短期氮添加对荒漠草原土壤微生物特征的影响

　　摘要:为探究荒漠草原土壤微生物特征对短期氮添加的响应,以宁夏荒漠草原为对象,参照国内外同类研究和当地的氮沉降量,设置 N0、N1、N2、N3、N4的5个处理,其纯氮添加量分别为0,2.5,5,10,15g/(m2·a),以尿素为氮源进行为期2年的氮添加试验,对不同氮添加处理下荒漠草原浅层土壤微生物特征进行了研究。结果表明:(1)随氮添加量的增加,荒漠草原0—20cm 土层土壤铵态氮含量呈升高的变化趋势,硝态氮含量呈先升高后下降的变化趋势。在0—10cm 土层,N1、N2、N3、N4处理草地铵态氮含量较 N0处理分别增加了109.61%,136.52%,197.19%,198.88%,硝态氮含量以 N2处理草地最高,显著高于 N0、N3、N4处理(P<0.05)。(2)与 N0相比,施氮后0—10cm 土层土壤微生物量氮含量显著下降,N1、N2、N3和N4处理分别较 N0处理降低了37.54%,38.11%,28.56%,29.81%。(3)随氮添加量的增加,荒漠草原0—10cm 土层土壤真菌数量呈逐渐减少的变化趋势,N0、N1处理草地显著大于 N3、N4处理草地(P<0.05)。PcoA 分析显示高氮添加处理(N3、N4)对荒漠草原土壤amoA 区、nirK 区微生物的群落结构有显著改变。高氮添加(N3,N4)会对荒漠草原土壤微生物群落产生负面影响,具体表现为真菌数量减少,硝态氮含量降低,氮转化微生物的α 多样性和优势菌丰度降低、群落结构发生显著改变。

　　关键词:氮添加;荒漠草原;酶活性;微生物特征;氮转化微生物

　　土壤是一切陆地植物赖以生存的基础,也是陆地生态系统中最大的氮沉降承受者。在过去的一个世纪里,由于工业和农业的快速发展,全球氮沉降量增加了3~5倍[1]。已有研究[2]表明,短期或少量 N 沉降在一定程度上可缓解植物生长所受的 N限制,但持续的外源氮输入会造成土壤养分流失,微生物群落结构改变和多样性的丧失的严重后果。土壤微生物具有生命周期短,生存环境敏感的特点,它们驱动土壤养分循环,并对土壤环境变化迅速做出反应,最终发生结构组成上的改变[3]。

　　王志瑞等[4]、Zhao等[5]认为,长期氮添加会降低土壤微生物生物量,但短期氮添加对土壤微生物生物 量 的 影 响 至 今 仍 没 有 一 致 的 结 论。Zhang等[6]综合分析了来自全球的151项研究结果认为,氮添加降低了总微生物生物量、细菌生物量、真菌生物量、生物量碳和微生物呼吸,且这些负面效应随着氮的施用速率和试验时间的延长而增加。

　　土壤微生物驱动的氮素转化过程主要包括生物固氮 和 氨 化、硝 化、反 硝 化 作 用,固 氮 菌 相 关 基 因nifH、氨氧化古菌基因amoA—AOA、氨氧化细菌基因amoA—AOB 和反硝化相关基因 nirK 被广泛应用于氮转化微生物的研究[7]。Shi等[8]研究发现,连续施氮6年后,中国亚热带森林土壤中 AOA 丰度显著增加,且施氮对 AOA 驱动的自养硝化存在潜在的促进作用。

　　在内蒙古贝加尔针茅草原,低氮添加显著增加了nirK 的相对丰度,高氮添加显著抑制了 nirK的相对丰度[9]。与以上研究结果不同,Zhang等[6]分析了大量氮添加对土壤微生物影响的资料认为,氮添加对陆地生态系统中所有土壤微生物的生长、组成和功能均具有一定程度的负面影响,且随着氮沉降速率和持续时间的增加,影响愈发显著,结构方程模型表明,施氮对土壤微生物数量和组成的负面影响可能导致土壤微生物呼吸的减弱。

　　在相关机制的研究方面,薛璟花等[10]认为,过量氮沉降会减少土壤微生物量、真菌生物量和真菌/细菌生物量比率,改变土壤pH,进而导致微生物群落结构发生改变。土壤呼吸率,土壤酶活性的减少和微生物对底物的利用模式的改变也会导致微生物功能的改变。总的来说,氮添加对土壤微生物的影响和驱动因素存在很大不确定性,需要更多的研究验证和发现。荒漠草原占宁夏天然草地面积半数以上,是典型的干旱生态系统,也是防风固沙、保持水土的重要生态屏障。

　　目前,有关氮添加对荒漠草原土壤影响的研究主要集中在土壤结构及理化性质的方面[11],有关土壤微生物特征的研究还相对较少。为探究荒漠草原土壤微生物特征对短期氮添加的响应,本研究对不同氮添加量下荒漠草原土壤氨硝态氮含量、微生物数量进行了测定,对amoA—AOA、nirK 基因进行了测序分析,并结合土壤环境因子的变化,探讨荒漠草原土壤微生物特征对短期氮添加的响应,以期为荒漠草原生态系统的保护和科学管理提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究区概况

　　研 究 区 位 于 宁 夏 东 部 的 盐 池 县 四 墩 子 行 政 村(37°04'—38°10'N,106°30'—107°41'E),海拔 1430m,地势为缓坡丘陵,土壤类型为灰钙土、淡灰钙土,土壤质地以沙壤、粉沙壤为主,属中温带大陆性气候、干旱、少雨、多风,昼夜温差大。年平均气温9.1 ℃,最热月(7 月)平均气温 23.9 ℃;当年降水量 205.2mm,较历年平均雨量偏少77.1mm;年均无霜期180天,年均蒸发量1231.5mm,年均日照时间2769h。草地类 型 为 荒 漠 草 原,主 要 物 种 有 草 木 樨 状 黄 芪(Astragalus melilotoides),华 北 白 前 (Cynanchumkomarovii),牛枝子(Lespedezapotaninii)等。

　　1.2 试验设计

　　选取较为平坦的荒漠草原为研究对象,于2018年5月开始进行氮添加处理,参照国内外同类研究[12]和当地的氮沉降量设5个施氮梯度,即 N0、N1、N2、N3、N4,其纯氮添加量分别为0,2.5,5,10,15g/(m2·a),使用尿素(CO(NH2)2)作为 N源,将每个小区每次所需喷施的尿素溶解于等量水中,每月1次,分5次均匀喷洒在各小区内。按照处理水平的要求,对照小区(N0)喷洒相同量的水。试验采用随机区组设计,每个梯度重复3次,总计15个小区,每小区面积5m ´4 m,氮添加后各处理的土壤理化性质。

　　1.3 植被调查与样品采集

　　2020年7月,在每个小区内随机选取3个取样点,用灭过菌的铲子分0—10,10—20cm 采集土壤样品,去除杂物及植物残体等,将同层的3个样品混合均匀,迅速装入灭菌袋中带回实验室。一部分用液氮冷冻后进行测序分析;另一部分置于4 ℃冰箱中保存,用于土壤生物学指标的测定;部分风干后过2mm 筛,用于土壤pH 及养分指标测定。同时,用环刀分层采集土壤样品,用于土壤容重和含水率的测定。2020年8月,在每个小区随机设置1个1m×1m 的样方,调査植物群落物种组成,分种测定各个物种的生物量。其中,地上生物量以1 m2 样方中各物种的风干重量计测,根系生物量采用根钻法测定。

　　1.4 测定指标与方法

　　土壤理化性质的测定参照《土壤农化分析》[13],土壤容重(BD)采用环刀法测定;土壤pH 采用酸度计测定(土水比为 1∶5)。土壤有机碳(SOC)采用ElementalrapidCScube元素分析仪(德国 Elementar公司)测 定;土 壤 全 氮 (STN)采 用 KjeltecTM8400全自动凯氏定氮仪(瑞典 Foss公司)测定。土壤微生物量碳(MBC)和土壤微生物量氮(MBN)均采用氯仿熏蒸浸提法,MBC采用 TOC—VCPH 总有机碳分析仪(日本岛津公司)测定,MBN 采用 AutoAnalyzer3—AA3流动分析仪测定(德国Seal公司);土壤铵态氮(NH4+ -N)和硝态氮(NO3- -N)均采用1mol/L的氯化钾浸提,AutoAnalyzer3—AA3流动分析仪测定。

　　土壤微生物数量采用平板涂抹培养计数法测定,以牛肉膏蛋白胨培养基培养细菌,马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)培养真菌,改良的高氏一号放线菌培养基培养放线菌。土壤氮转化微生物采用 DNA 测序方法测定。由上海天昊生物科技有限公司对样本进行 DNA提取和质量检测(Nanodrop+琼脂糖电泳)、PCR 扩增、文库构建和上机测序(Illumina2×250bp)。

　　1.5 数据统计与分析采用 Excel2010 软 件 对 数 据 进 行 基 础 处 理,SPSS23软件进行数据的统计分析,Origin2018和R软件进行制图;采用 one-wayANOVA 和 Duncan法进行方差分析和多重比较。

　　2 结果与分析

　　2.1 对土壤微生物量碳、氮的影响0—10cm 土层,MBC含量以 N2处理草地最高,为180.17mg/kg,N3处理草地最低,为142.01mg/kg。氮添 加 显 著 降 低 了 荒 漠 草 原 土 壤 MBN 含 量(P<0.05),与 N0相比,N1、N2、N3和 N4处理草地土壤 MBN含量分别降低了37.54%,38.11%,28.56%,29.81%,但各处理草地间差异不显著(P>0.05)。10—20cm土层,MBC含量以 N3处理草地最高,为175.59mg/kg,N0处理草地最低,为124.00 mg/kg。土壤MBN 随氮添加量的增加呈波动性变化,N1处理草地的12.17 mg/kg 显 著 高 于 N0 处 理 草 地 的 7.81mg/kg(P<0.05)。这说明氮添加主要对0—10cm土层土壤微生物生物量产生影响,且土壤 MBN 对氮添加的敏感程度高于 MBC。

　　2.2 对土壤微生物数量的影响

　　荒漠草原土壤微生物以细菌为主,约占微生物总量的 68.86% ~81.59%;其次为放线菌,约占微生物总量的17.42%~31.01%;真菌占微生物总量的比例最小,仅为0.05%~0.16%。氮添加显著抑制了荒漠草原0—10cm 土层土壤真菌、细菌的生长,但对放线菌的影响未达到差异显著性水平。

　　0—10cm 土层,随氮添加量的增加,荒漠草原土壤真菌数量的变化范围为17.70×102 ~58.30×102 cfu/g,呈逐渐下降趋势,N0、N1处理草地显著大于 N3、N4处 理 草 地 (P <0.05);细 菌 数 量 的 变 化 范 围 为17.70×102~35.70×102cfu/g,N0处理显著大于 N3处理(P<0.05)。放线菌数量的变化范围为59.00×104~94.00×104cfu/g。10—20cm 土层,不同氮添加处理对荒漠草原土壤真菌、细菌、放线菌数量均无显著影响(P>0.05)。

　　2.3 氮添加对土壤氮转化微生物的影响

　　2.3.1 对土壤铵态氮、硝态氮的影响

　　氮添加增加了荒漠草原土壤 NH4+ -N 含量,在0—10cm 土层,与 N0相比,N1、N2、N3、N4处理草地土壤的 NH4+ -N 含量分别增加了109.61%,136.52%,197.19%和198.88%;10—20cm 土层,NH4+ -N 含量增 长 较 缓,N1、N2、N3、N4 处 理 草 地 分 别 增 加 了4.71%,34.90%,96.47%和92.55%。

　　从剖面变化看,N0处理草地10—20cm 土层 NH4+ -N 含量显 著 高 于0—10cm 土层(P<0.05),其他氮添加处理草地均以0—10cm 土层最高,但与10—20cm 土层之间差异不显著。

　　NH4+ -N/STN 的变化趋势与 NH4+ -N含量的变化趋势基本一致,在0—20cm 土层土壤中均以 N4处理草地最高,显著高于 N0和 N1处理草地,N3处理草地显著高于 N0处理草地(P<0.05)。各处理草地0—10cm 土层土壤 NH4+ -N/STN 总 体 高 于10—20cm土层,其间差异不显著(P>0.05)。

　　随氮添加量的增加,荒漠草原0—10cm 土层土壤NO3- -N含量呈先上升后下降的变化趋势,变化范围为7.15~13.61mg/kg,以 N2处理草地最高,显著高于N0、N3、N4 处 理 草 地;NO3- -N/STN 为 1.23% ~2.22%,N1处理草地显著高于 N0、N3处理草地(P<0.05)。10—20cm 土层土壤 NO3- -N 含量为3.59~7.47mg/kg;NO3- -N/STN 变 化 范 围 为 0.43% ~1.13%,N1处理草地显著高于 N0处理草地(P<0.05)。各氮添加处理草地中,土壤 NO3- -N 含量和 NO3- -N/STN均表现为0—10cm 土层高于10—20cm 土层。荒漠草原土壤NO3- -N主要分布在0—10cm土层,且在低氮添加条件(N1,N2)下含量最高。

　　2.4 土壤微生物特征与土壤环境因子的相关关系

　　土壤 NH4+ -N 含量与土壤 pH、amoA—AOA 优势菌丰度呈极显著正相关关系;与nirK 优势菌丰度呈极显著负相关关系(P<0.01),与真菌数量(FM)呈显著负相关关系(P<0.05)。土壤amoA—AOA 优势菌丰度与 nirK 优势菌丰度呈极显著负相关关系(P<0.01),与细菌数量(BM)呈显著负相关关系(P<0.05)。土壤pH 与amoa—AOA优势菌丰度呈极显著正相关关系(P<0.01),与nirK优势菌丰度和 FM 呈显著负相关关系 (P <0.05)。说明影响amoA—AOA 和 nirK 优势菌丰度的主要因素有土壤真菌数量、细菌数量、pH 和 NH4+ -N含量,且土壤pH、NH4+ -N 含量对土壤真菌数量有显著影响。

　　3 讨 论

　　3.1 氮添加对荒漠草原土壤微生物量碳、氮及微生物数量的影响

　　土壤微生物生物量指土壤微生物体内的碳、氮总和,是评价土壤生物学性状和养分状况的常用指标。本研究中,氮添加显著降低了0—10cm 土层土壤真菌数量和 MBN 含量,此结果与 Zhou[14]等的研究结果基本一致,真菌群落的生物量 C∶N 显著高于细菌群落,而氮添加可能减少真菌群落生物量,进而降低土壤微生物量。

　　土壤真菌数量的下降可能与土壤性质的改变和养分的不均衡分配相关[18],细菌比真菌更适宜碱性土壤环境,氮添加导致土壤pH 的增加对真菌的发育更为不利,本研究相关分析中,土壤真菌数量与pH、铵态 氮 的 负 相 关 关 系 也 证 实 了 这 一 结论。但氮素不是影响土壤微生物生物量的唯一因子,当氮添加量增加时,过量的氮输入可能造成土壤氮饱和,使土壤微生物受到 pH、水分、SOC 等因子的制约,造成 MBC 含量不显著变化[15]。

　　从剖面变化上看,本研究0—10和10—20cm 土层 MBC、MBN 含量没有显著差异,但多数研究[16]认为,表层土壤中含有更多的植物凋落物和有机质,可用于促进土壤微生物的 生 长,故 无 论 添 加 氮 素 与 否,0—10cm 土 层MBC、MBN 含量都应高于10—20cm 土层,原因可能是荒漠草原植被稀疏,表层土壤风蚀严重、蒸发强烈,植物凋落物等输入表层土壤的有机质较少,加之土壤结构松散,保水保肥能力差,养分流失和水分蒸发的双重限制降低了荒漠草原土壤表层的微生物量。

　　3.2 氮添加对荒漠草原土壤氮转化微生物的影响

　　氮添加增加了土壤无机态氮含量,有利于微生物的生长[17],同时会使土壤微生物 数 量 下 降、活 性 降低。尿素能够分解释放铵根离子,增加土壤中铵态氮含量,在微 生 物 群 落 的 驱 动 下 发 生 硝 化 反 应,有 研究[19]认 为,氮 添 加 会 增 加 土 壤 中 NH4+ - N 和NO3- -N 含量,并促进土壤氨化和硝化作用。本研究中随氮添加量的增加,荒漠草原土壤 NH4+ -N含量逐渐增加,但 NO3- -N 含量先增加后减少,此结果与上述研究结果部分相同,但存在一定差异。

　　一是适宜浓度的氮添加可以补充受氮素限制生态系统中的氮素,但添加量的增加可能会使植物群落对无机氮的需求达到饱和,若受氮素限制的生态系统能够有效地固定外源氮素,并且植物有较强的吸收利用能力,则多数进入土壤的 NH4+ -N 和 NO3- -N 会被植物吸收而退出土壤生态系统[20];二是植物会优先吸收土壤中的 NO3- -N 作为生长发育所需的养分,从而降低土壤中 NO3- -N 的净剩余量;三是相较于带正电荷的 NH4+ -N,带负电荷的 NO3- -N 更容易通过淋溶作用而损失[21]。

　　4 结 论

　　(1)氮添加显著增加了荒漠草原土壤的铵态氮含量,同时降低了0—10cm 土层土壤真菌数量和微生物量氮含量(P<0.05)。

　　(2)与 N0相比,低氮添加处理(N1、N2)的荒漠草原土壤含有较多的硝态氮和微生物量碳氮,氮转化微生物的优势菌丰度较高,且群落结构无明显改变,高氮添加处理(N3、N4)的荒漠草原土壤铵态氮含量较高,但氮转化微生物群落结构发生了显著改变。

　　参考文献:

　　[1]LamarqueJF.Assessingfuturenitrogendepositionandcarboncyclefeedbackusingamultimodelapproach:Analysisofnitrogendeposition[J].JournalofGeophysicalResearchAtmospheres,2005,110(19):148-227.

　　[2]VitousekP,AberJ,HowarthR,etal.Humanalterationoftheglobalnitrogencycle:sourcesandconsequences[J].Ecologicalapplications,1997,7(3):737-750.

　　[3]GriffithsBS,RitzK,BardgettRD,etal.Ecosystemresponseofpasturesoilcommunitiestofumigationinducedmicrobialdiversityreductions:Anexaminationofthebiodiversity-ecosystemfunctionrelationship[J].Oikos,2000,90(2):279-294.

　　[4] 王志瑞,杨山,马锐骜,等.内蒙古草甸草原土壤理化性质和微生物学特性对刈割与氮添加的响应[J].应用生态学报,2019,30(9):3010-3018.

　　[5] Zhao Q,ZengD H.Nitrogenadditioneffectsontreegrowthandsoilpropertiesmediatedbysoilphosphorusavailabilityandtreemediatedbysoilphosphorusavailablityandtreespeciesidentity[J].ForestEcologyandManagement,2019,449:e117478.

　　[6] ZhangTA,ChenH Y H,RuanHH.Globalnegativeeffectsofnitrogendepositiononsoilmicrobes[J].TheISMEJournal,2018,12(7):1817-1825.

　　作者：宋珂辰1,王 星1,许冬梅1,2,李永康1,撒春宁1,马 霜1