摘要：本研究旨在筛选出能产生促进植物生长的挥发性有机化合物(volatileorganiccompounds，VOCs)的潜在植物根际促生菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)，考察其VOCs对植物的促生作用及其它促生功能，为研发微生物肥料提供新的思路及可靠的材料。以本实验室从海洋样品中分离保存的48株功能菌为供试菌株，通过二分隔平板实验、VOCs盆栽实验进行筛选，结合菌株的16SrRNA进行鉴定，通过气相色谱-质谱联用的方法(GasChromatography-Mass，GC-MS)对菌株所产VOCs成分进行分析。通过平板活性实验对细菌的固氮，溶磷及产IAA进行活性检测。研究结果显示：筛选得到1株潜在PGPR-GX14001，其所产生的VOCs对本氏烟草(Nicotianabenthamiana)和上海青(BrassicachinensisL.)均表现出明显的促生作用，菌株经16SrRNA鉴定为橙色微杆菌(Microbacteriumaurantiacum)。经GC-MS对其VOCs成分分析，共得到7种特异性化合物。经平板活性检测，GX14001具有较强的溶有机/无机磷活性和一般固氮活性，而其产IAA能力较弱，为1.737μg/mL。PGPR可通过不同的促生机制对植物表现出促生作用，研究结果表明GX14001所产VOCs对植物有明显促生作用，其他方面的促生活性并不高，两者之间不存在较高的正相关性，说明其最主要的促生作用是通过所产生的VOCs获得的。
关键词：植物促生菌;挥发性有机物;橙色微杆菌;溶磷
化肥和农药在我国农业历史上发挥了巨大的增产作用，但长期使用化肥会造成土壤板结，肥力下降，农产品品质降低，污染环境等一系列问题[1]。随着现代生物科学技术的进步，应用微生物代替化肥和农药在农业方面有广泛的应用前景。微生物肥料因其生产成本低、效果好、不污染环境以及有助于农业可持续发展等特点受到广泛关注。由于微生物肥料的快速稳定发展，对PGPR的研究与开发也成为研究热点[2]。
PGPR是一类能够在植物根际定殖，通过固氮、溶磷、抗病、增加植物对营养元素的吸收、调整植物激素浓度以及产生挥发性有机物等多种机制促进植物生长的有益微生物的总称。微生物产生挥发性有机物是促进植物生长的一个重要促生机制，已有研究报道，枯草芽孢杆菌[3-7]，解淀粉芽孢杆菌[3，7]、产碱假单胞菌[8]、放线菌[9]、木霉真菌[10]、枝孢样枝孢霉[11]等多种微生物产生的VOCs能够通过调节植物激素[12]，诱导系统耐受性[13]及系统抗性[14]等多方面促进植物的生长。
本实验从实验室已保存的48株菌株中通过二分格平板实验筛选得到一株所产VOCs对植物有明显促生作用的潜在PGPR菌株GX14001，经16SrRNA鉴定后进行了VOCs盆栽实验，以进一步验证其所产VOCs对植物的促生作用。通过GC-MS对GX14001所释放的VOCs进行了成分检测，之后对其固氮、溶磷、产IAA活性进行了研究。本研究为微生物菌肥资源的开发与利用提供新的选择。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试菌株
供试菌株为从海洋分离得到的48株可培养的功能菌株，保藏于广西多糖材料与改性重点实验室。
1.1.2植物材料本氏烟草(Nicotianabenthamiana)，上海青(BrassicachinensisL.)。
1.1.3培养基TSA培养基，TSB培养基及MS培养基均购自青岛海博生物技术有限公司，蒙金娜有机培养基[15]，PKO无机培养基[16]，Ashby无氮培养基[17]，埃利希氏反应显色试剂。
1.1.4主要试剂和仪器细菌基因组DNA提取试剂盒及所用引物合成：天根生化科技有限公司;PCR扩增反应相关试剂及限制酶等：北京康润诚业生物科技有限公司;PCR扩增仪：BioRadT100;智能人工气候箱：浙江托普RTOP-1000B;摇床：上海旻泉MQD-B1R;固相微萃取探针，购自青岛贞正分析仪器有限公司;气相色谱-质谱联用仪：安捷伦5975C-7890A。
1.2方法
1.2.1细菌发酵液的制备将供试细菌接入TSB液体培养基中培养，培养条件：30℃，200r/min，24h。之后将菌液用无菌水稀释至1×108CFU/mL备用。
1.2.2细菌与烟草共培养
1.2.2.1烟草预处理用75%(V/V)医用酒精对烟草种子上下轻缓颠倒消毒2-3min后，再用1%的次氯酸钠溶液(V/V)消毒2-3min，之后用无菌水将烟草种子冲洗4-5遍，清洗种子表面的消毒剂，防止残留消毒剂影响种子萌发。将消毒后的烟草种子点种在MS培养基上，用封口膜将平板封好后，放在25℃智能人工气候箱培育至发芽出苗。智能人工气候箱的条件为白天16h，黑夜8h，温度25℃。
1.2.2.2共培养实验本实验采用9cm二分格培养皿进行实验，一侧培养烟草，另一侧培养细菌，由于物理界限，细菌的分泌及代谢物不能和烟草进行接触和交流，但细菌释放的挥发性有机物可通过培养皿上空与烟草进行交流和作用。将培养5d生长状况一致的烟草苗移栽到二分格培养皿的MS培养基中，每个培养皿移栽5棵，保持每棵烟草间距一致，在另一侧TSA培养基接种10μL菌液，菌含量约为1×108CFU/mL，每个菌株做3个平行，以接种10μL灭菌水作为对照。将平板用封口膜封好后，放入智能人工气候箱培养，培养条件与之前一致，培养14d之后对烟草的生物量进行测量与统计。
1.2.3菌株鉴定采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取供试菌株的总DNA。用细菌通用引物27-F：5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'，1492-R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'进行16SrRNA基因的扩增。PCR反应体系：模板1μL，正反向引物各1μL，2×TaqPCRStarMIXwithLoadingDye25μL，用ddH2O补足至50μL。PCR反应条件：95℃预变性4min;95℃1min，55℃1min，72℃2min为一个循环，进行32个循环;72℃延伸10min;最后4℃10min。将PCR扩增产物送上海生工进行测序，所得序列通过Ezbiocloud进行序列同源性比对分析。
1.2.4盆栽实验将上海青种子进行消毒处理后，播种于已高压湿热灭菌的土壤中。每个盆栽3株幼苗，待长出两叶一心时，对其作处理。将菌株在TSA培养基上活化，挑取单菌落至装有TSB液体培养基的瓶子中，30℃，200r/min培养24h后放置盆栽下方，用封口膜将盆栽装置接口处封好，防止细菌产生的挥发性有机物渗出，确保其能与植物的根部处于同一密闭空间。培养21d后进行各项指标的测量与记录。
1.2.5顶空固相微萃取气质联用法(headspacesolidphasemicroextraction/GC-MS，HS-SPME/GC-MS)分析菌株产生的VOCs成分1.2.5.1细菌样品预处理将供试细菌GX14001在装有TSB液体培养基的固相微萃取瓶中进行活化培养，30℃，200r/min培养24h备用。
1.2.5.2萃取探针的预处理本实验选择活性炭/聚二甲基硅氧烷/聚二乙烯基苯(ACAR/PDMS/DVB)复合涂层的固相微萃取探针，适合较宽范围挥发性有机物的萃取。萃取探针使用前进行老化，老化条件为260℃，60min。1.2.5.3GC-MS条件实验条件：载气为He;不分流进样;进样口温度为230℃;炉温起始为40℃，保持3min，以3℃/min升温至140℃，保持2min;再以20℃/min升温至230℃，保持2min;离子源为EI源;采用Nist08谱库进行检索。
2结果
2.1菌株产生的VOCs对烟草的促生作用
对48株菌株进行VOCs二分隔平板实验，培养14d后对烟草的生物量进行测量与统计。研究发现，GX13594、GX13747、GX14001、GX14016、GX14066、GX14070、GX14201这7个菌株处理组的鲜重，根长，侧根数，叶片长及叶片宽均显著高于CK对照组(P<0.01)，结果表明这7个菌株所产生的挥发性有机物对烟草都具有明显的促生作用。
3讨论
微生物大致可通过直接和间接两个促生机制来促进植物的生长[18]。其中直接促生机制主要是通过调整植物激素浓度，增加植物对养分的吸收以及释放挥发性有机化合物(VOCs)来促进植物的生长;间接促生机制是通过诱导植物产生系统抗性和抑制病原菌的入侵来促进植物生长[19]。与其他促生机制不同，微生物释放的VOCs可以在不与植物进行物理接触的情况下，通过提高植物生物量、抗病(虫)性和非生物胁迫耐性来发挥对植物的促生作用，这是其优势所在[20]。
本文主要研究了从海洋分离得到的橙色微杆菌GX14001的VOCs对植物生长的促生作用，对其产生的VOCs成分及菌株的其他促生特性进行了分析检测。迄今为止，关于PGPR所释放的VOCs对植物促生作用的研究大多以假单胞菌属和芽孢杆菌属为主，微杆菌属的报道较少。
Cordovez等[21]研究表明微杆菌菌株EC8-VOCs通过调节植物根部硫和氮的代谢从而促进植物生长，并且发现其诱导植物生长促进具有组织特异性的。本文研究发现橙色微杆菌GX14001-VOCs能够诱导植物叶片和鲜重增加，在模式植物本氏烟草和经济作物上海青中均有体现。对微生物产生的VOCs的收集和成分分析一般采用顶空固相微萃法[22]和气相色谱-质谱法。目前已报道的PGPR释放的能促进拟南芥生长的VOCs主要有以下几种：2，3-丁二醇以及合成2，3-丁二 醇的前体乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)[3]，低浓度的1-己醇以及高浓度的正十五烷[23]，1-癸烯[10]等。
Velázquez-Becerra等[24]研究表明运动节杆菌UMCV2产生的二甲基正十六胺能促进紫花苜蓿的生长发育。Yamagiwa等[25]发现促进植物生长的真菌Talaromycessp.产生的β-石竹烯能够有效促进甘蓝型油菜幼苗的生长。Paul等[11]研究发现根际促生真菌CladosporiumcladosporioidesCL-1产生的VOCs， α-蒎烯、(-)反式-石竹烯、2，2，5，5-四甲基四氢呋喃、脱氢香橙烯以及(+)-苜蓿烯对烟草幼苗具有促进能力。本实验筛选得到的GX14001所产生的VOCs经GC-MS分析表明，与对照相比有7种特异性化合物，可分为苯基类和烷类化合物。其中烷类化合物有4-甲基-癸烷、十二烷、二十五烷和9-辛基-十七烷四类。
烷类化合物是目前已报道的具有活性的挥发性物质，该GC-MS分析得到的十二烷和二十五烷曾在2017年被Jishma等报道是能促进植物生长的VOCs成分[26]。苯基类化合物有邻乙基甲苯，1，2，3-三甲苯和1，2，4-三甲苯。苯基类化合物大都能在细菌/真菌的挥发性物质中被检测到，乙苯曾在生物测定实验中被发现具有杀虫作用[27]，最终结果表明十二烷，1，2，3-三甲苯，邻乙基甲苯及二十五烷的含量相对较高，结合前人研究推测GX14001释放的VOCs起主要促生作用的成分可能为十二烷及二十五烷，关于其他成分的具体作用还需进一步分析研究。
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4结论
本实验通过二分隔平板实验及VOCs盆栽实验发现GX14001释放的VOCs对烟草和上海青的根部及叶片的生长都有显著的促进作用，该菌株经16SrRNA分子生物学鉴定为橙色微杆菌。GC-MS结果显示GX14001释放的VOCs成分中起主要促生作用的成分为烷类。平板活性检测结果显示，GX14001菌株具有一定的溶磷和固氮作用，而产IAA能力较低。研究结果表明，该菌株促进植物生长主要是通过产生挥发性有机化合物(VOCs)来实现的，通过对菌株其他活性的检测表明橙色微杆菌是促进植物生长的多功能有效菌株。本项工作为微生物肥料的研制与开发提供参考依据。
参考文献
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作者：高亚慧 姜明国 丰景 周桂
