三七总皂苷白蛋白微球注射液在家兔体内的药物代谢动力学研究

　　摘要:目的:对三七总皂苷白蛋白微球注射液(PNS-BSA-MS-inj)在家兔体内的药物代谢动力学进行研究。方法:以新西兰大白兔为模型动物，以血塞通注射液为对照制剂，关节腔注射PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液，运用UPLC-MS/MS技术检测家兔体内人参皂苷Rb1的血药浓度变化，同时建立人参皂苷Rb1的血浆定量分析方法。利用DAS2.0软件分析PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液的药物代谢动力学参数差异。结果:家兔关节腔注射PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液后，药物代谢动力学参数如下:半衰期(t1/2)分别为59.350h和35.694h，药峰浓度(Cmax)分别为34.340μg/mL和42.340μg/mL;达峰时间(tmax)分别12h和1h;药时曲线下面积(AUC0-∞)分别为2265.702mg/(L·h-1)和1961.411mg/(L·h-1);PNS-BSA-MS-inj的相对生物利用度为116%。结论:与血塞通注射液相比，PNS-BSA-MS-inj能显著提高药物在家兔体内的滞留时间，并能提高药物在家兔体内的生物利用度，说明PNS-BSA-MS-inj具有缓释效果。

　　关键词:三七总皂苷;白蛋白微球;关节腔注射;人参皂苷Rb1;UPLC-MS/MS

　　三七总皂苷(panaxnotoginsengsaponins，PNS)为三七的主要有效成分，目前研究表明其药理作用广泛，除具有抗炎、镇痛、抗血栓、抗心律失常、抗氧化、抗肿瘤[1]等药理作用外，还具有抑制促炎症因子分泌、抑制金属蛋白酶的活性、保护软骨基质、抑制滑膜炎症等作用[2]。

　　医学药物论文： 临床药学干预在抗菌药物合理使用中的效果观察

　　有研究表明采用膝关节腔内直接注射三七总皂苷及其制剂，可使药物直接分布于病变局部，能够改变骨性关节炎的病理状态，从而发挥治疗骨性关节炎或者骨折等疾病的作用，具有操作方便、起效快速、药物易于吸收等优点[3，4]。但常规关节腔注射给药，大量药物渗漏进入体循环，药物在关节组织滞留时间短，治疗效果不理想，且需要频繁用药，不良反应大，病人的顺应性差[5]。因此，注射用缓控释制剂已逐渐成为关节腔注射给药的研究热点[6-8]。

　　白蛋白微球是一种可作为控制药物释放的新型给药系统，由于其与人体组织的亲和性较好，利用白蛋白将药物制成微球后，不仅能够显著增加药物在血浆的溶解性，提高药物的选择性和生物利用度[9]，包封在微球中的药物还具有缓释的作用，能在降低不良反应的同时具有延长药效的作用[10]。为了延长药物在关节腔内使用时间，本研究以牛 血清蛋白(bovinesrumalbumin，BSA)为载体材料，PNS为药物通过加热固化法制备得到三七总皂苷白蛋白微球，使其具有缓释作用，提高生物利用度，降低给药剂量。本实验通过家兔关节腔注射PNS-BSA-MS-inj，以血塞通注射液作为参比制剂，采用UPLC-MS/MS法测定不同时间家兔血浆中的人参皂苷Rb1的含量，考察药物在家兔体内的药物代谢动力学特征。

　　1仪器与材料

　　1.1仪器WASTERSXEVOTQ超高液-质谱联用仪(美国Waters公司)，AE/240型十万分之一电子分析天平(上海梅特勒仪器有限公司)，TGL-16B型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，HC-2062型高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)，MTN-2800D型氮吹浓缩装置(天津奥特赛思斯仪器有限公司)，MX-S型涡旋混合机(美国SCILOGEX公司)，SK8200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)。

　　1.2药品与试剂PNS-BSA-MS-inj(实验室自制，平均粒径为9.53±4.83μm，平均载药量为6.87±0.03%)，注射用血塞通冻干粉(批号:F807036a3，哈尔滨珍宝制药有限公司)，人参皂苷Rb1对照品(批号:110704-201625，中国食品药品检定研究院)，地高辛对照品(批号:133593，中国食品药品检定研究院)，生理盐水(贵州天地有限公司)，甲醇(色谱纯，美国天地公司)，乙腈(色谱纯，美国天地公司)，屈臣氏蒸馏水(屈臣氏集团公司)，实验室自制蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

　　1.3动物新西兰大白兔，普通级，雌雄各半，体质量2.5～3.0kg，由贵州医科大学实验动物中心提供，合格证号:SCXK-(黔)2018-0001。

　　2方法与结果

　　2.1溶液的配制

　　2.1.1对照品溶液的配制精密称取人参皂苷Rb1对照品10.68mg，加甲醇溶解并定容至10mL，即得浓度1068μg/mL人参皂苷Rb1的对照品溶液，置于4℃冰箱保存，临用时稀释成适当对照品溶液。

　　2.1.2内标溶液的配制精密称取地高辛对照品2.4mg，用甲醇溶解并定容至25mL，即得浓度为96μg/mL的地高辛对照品溶液，置于4℃冰箱保存，临用时稀释成适当对照品溶液。

　　2.2血浆样品的处理方法精密吸取地高辛对照品溶液10μL，加入到精密吸取的500μL血浆上清液中，涡旋混合1min，加入乙腈1490μL，涡旋混合3min，10000r/min离心15min，取全部上清液转移至5mL一次性EP管，在50℃下N2吹干，用100μL的甲醇复溶，涡旋混合3min，超声5min，10000r/min离心15min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤作为供试品溶液，进样5μL，进行UPLC-MS/MS法检测分析。

　　2.3色谱条件采用XBridge?UPLCCSHTMC18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，以0.1%甲酸水溶液(A)-0.2%甲酸乙腈为流动相(B)，采用梯度洗脱(0min，80%A;3min，75%A;5min，60%A;7min，30%A;8min，10%A;9min，80%A;10min，80%A)，流速为0.3mL/min，柱温为30℃，样品室温度为10℃，进样体积为5μL。

　　2.4质谱条件采用电喷雾电离源负离子(ESI负源)模式，多反应检测模式(MRM)。人参皂苷Rb1，地高辛的检测离子对分别为m/z1107.6→179.1，825.4→825.3，毛细管电离电压为3.0KV;离子源温度为200℃;一级锥孔电压为30V;脱溶剂气体为N2，脱溶剂气温度为500℃;脱锥孔反吹气流量为50L/h;溶剂气流量为800L/h;碰撞气体为Ar，碰撞气流速为0.15mL/min。采用MRM模式，扫描范围m/z100～1000;各个定量离子峰质谱条件，即碰撞能量与锥孔电压。

　　2.5方法学考察

　　2.5.1专属性考察分别将空白血浆(阴性样品)，含一定浓度人参皂苷Rb1对照品及内标溶液(地高辛)的空白血浆(对照样品)和关节腔注射PNS-BSA-MS-inj后的含药血浆加入内标溶液的样品(样品)，按“2.2”项的血浆处理方法处理后分别得到阴性样品供试液、混合对照品供试液以及样品供试液，分别取各样品进样测定，记录色谱图。结果表明，该方法专属性良好，处理后供试液无杂质干扰，血浆内源性物质和其他代谢物在人参皂苷Rb1和地高辛附近无干扰杂峰出现，可用于人参皂苷Rb1和地高辛体内定量分析。

　　2.5.2线性关系的考察

　　分别精密吸取10μL不同浓度的人参皂苷Rb1对照品溶液置于离心管中，每浓度点各取平行样3份，在50℃下使用N2浓缩仪挥去甲醇，精密加入空白血浆500μL，按照“2.2”项下进行处理，即得含人参皂苷Rb1当量浓度分别为0.267、0.801、2.403、7.209、21.627、64.881μg/mL的血浆供试液。以人参皂苷Rb1的当量浓度为自变量(X)，以人参皂苷Rb1的峰面积与内标物峰面积的比值为因变量(Y)绘制标准曲线，进行回归方程分析。得人参皂苷Rb1的回归方程为Y=1.087X-0.037，(r=0.995)。结果表明，人参皂苷Rb1的当量浓度分别在0.267-64.881μg/mL范围内呈良好线性关系，可用于人参皂苷Rb1体内定量分析。

　　2.5.3精密度试验

　　分别精密吸取2组低、中、高3个浓度(8.01、72.09、519.05μg/mL)的人参皂苷Rb1对照品溶液10μL，每个浓度平行样5份，在50℃下于N2下挥干甲醇置于离心管中备用。于备用的离心管中加入空白血浆500μL，其余按照“2.2”血浆样品的处理方法处理后，作为质量监控样品供试液，其中1组1d内连续进样3次，计算日内精密度;2组每天测定1次，连续测定3d，计算日间精密度。结果显示人参皂苷Rb1的日内精密度RSD分别为18.36%、7.61%和6.87%，RSD均<20%;日间精密度RSD分别为19.40%、17.91%和7.61%，均<20%，基本满足生物样品体内定量分析质量规范要求。

　　2.5.4回收率试验

　　(1)提取回收率试验:分别用精密吸取低、中、高3个质量浓度(8.01、72.09、519.05μg/mL)工作液10μL，每个浓度平行样5份，在50℃下N2下挥干甲醇于离心管中备用。加入空白血浆500μL，其余按照“2.2”血浆样品的处理方法处理后，转移上清液至备用的5mL的离心管中，于N2下挥干后同上复溶，作为A溶液;另用甲醇配制相应浓度的人参皂苷Rb1对照品溶液，不经提取进样同量测定，并以此为标准，作为B溶液。

　　将A溶液和B溶液分别检测分析，分别测定人参皂苷Rb1和地高辛的峰面积并计算两种溶液的比值。结果显示人参皂苷Rb1低、中、高3种浓度的提取回收率分别为(101.38±12.08)%、(88.82±13.97)%、(98.11±6.10)%，均>80%;RSD分别为11.92%、15.73%、6.21%，均<20%。(2)方法回收率:分别精密吸取低、中、高3个浓度(8.01、72.09、519.05μg/mL)的人参皂苷Rb1对照品溶液10μL，每个浓度平行样5份，在50℃下于N2下挥干甲醇于离心管中备用，于备用的离心管中加入空白血浆500μL，其余按照“2.2”血浆样品的处理方法处理，记录人参皂苷Rb1和地高辛的峰面积，分别将人参皂苷Rb1和地高辛的比值，通过随行标准曲线计算人参皂苷Rb1的浓度，与相应的标示浓度进行比较，计算方法回收率。结果显 示，人参皂苷Rb1的低、中、高浓度方法回收率分别为(91.65±13.53)%、(116.59±5.75)%、(81.47±1.83)%，均>80%;RSD分别14.76%、4.93%和2.25%，均<20%。

　　2.5.5稳定性

　　分别用微量进样器取低、中、高3个质量浓度(8.01、72.09、519.05μg/mL)工作液10μL，每个浓度平行样5份，在50℃下于N2下挥干甲醇于离心管中备用。于备用的离心管中加入空白血浆500μL，其余按照“2.2”血浆样品的处理方法操作，配制成低、中、高3个质量浓度的血浆样品，分别放入-20℃条件下保存24h后反复冻融3次以及常温下放置6h。每一浓度进行5样品分析，结果显示人参皂苷Rb1低、中、高3种浓度冷冻1d冻融3次的RSD分别为2.78%、12.29%和13.71%，均<15%，常温下放置6h的RSD分别为11.55%、6.16%和12.48%，均<15%。说明样品在常温和-20℃条件下稳定性良好。

　　2.6药物代谢动力学研究

　　2.6.1血浆样品的采集与处理

　　取健康新西兰大白兔8只，雌雄各半，体质量2.5～3.0kg，随机分为两组。分别于兔左关节腔注射1mLPNS浓度均为8.1mg/mL的PNS-BSA-MS-inj和血塞通注射液，给药前禁食12h，自由饮水，每个时间点从耳缘静脉取血2mL用于研究。第一组为对照组，注射血塞通注射液;第二组注射PNS-BSA-MS-inj。两组分别于给药后30min、1、2、4、6、8、12、24、48、72、96、120、144h耳缘静脉取血并放置于3mL预肝素化离心管中，摇匀，离心，4000r/min，15min，转移上清液，置于-20℃冰箱保存待测。分别将两组不同时间点的血浆按“2.2”项下方法操作，分别测定人参皂苷Rb1和地高辛的峰面积，带入回归方程，计算不同时间点的血药浓度。

　　2.6.2药物代谢动力学参数分析

　　关节腔注射血塞通注射液和PNS-BSA-MS-inj后，通过测定不同时间新西兰大白兔血浆的药物浓度，两种制剂的药物浓度与时间的关系曲线，采用DAS2.0药物动力学程序，分别对血药浓度与时间的关系采用统计矩法求药物动力学参数。

　　2.6.3药物代谢动力学研究结果

　　关节腔注射血塞通注射液和微球注射液后，血浆中人参皂苷Rb1浓度存在明显差异。关节腔注射血塞通注射液，关节腔渗漏较多，血浆中人参皂苷Rb1浓度呈上升趋势，1h达到最大值(Cmax=42.340μg/mL)6天后血浆中仍然存在人参皂苷Rb1(1.66μg/mL)，而关节腔注射微球注射液0.5h血浆中此时测不到血药浓度;12h以后才达到最大值(Cmax=34.340μg/mL)，PNS-BSA-MS-inj比血塞通注射液的Cmax要小得多，说明关节腔注射PNS-BSA-MS-inj，关节腔渗漏进入血液循环的药物量明显减少，间接说明渗漏进入血液循环中的药量少，在关节组织滞留时间长，能维持较高的关节局部浓度，提高疗效。

　　由两组药物动力学参数结果显示，PNS-BSA-MS-inj组半衰期和平均滞留时间都有延长(P<0.05)，且达到药物浓度峰的时间明显推后;PNS-BSA-MS-inj组AUC0-∞是血塞通注射液组的1.16倍。说明药物经过微球包封，能够起到减少药物渗漏，从而使药物长时间滞留于组织，维持局部的药物浓度，提高药物生物利用度。

　　3讨论

　　本实验以新西兰大白兔为模型动物，以血塞通注射液为对照，地高辛为内标物，对PNS-BSA-MS-inj在家兔体内的过程进行了初步研究。在实验中参考多篇文献[11，12]并进行预实验，最后确定流动相为乙腈和水，为了改善其和内标的峰型，在乙腈中添加0.2%的甲酸，在纯化水中添加0.1%的甲酸。在血浆样品处理方法过程中，曾选用乙腈和甲醇直接沉淀蛋白，结果发现血浆用量相同情况下，使用乙腈比甲醇的提取回收率提高近50%，故选择乙腈作为蛋白沉淀剂进行后续实验。

　　实验发现在30℃条件下N2吹干耗时约2h以上，故笔者考察了人参皂苷Rb1在30℃、40℃、50℃条件N2吹干耗时时长，并通过UPLC-MS/MS法检测其含量差异，发现50℃条件下N2吹干耗时只要1h左右，且含量与30℃、40℃条件下N2吹干相差不大，因此，在满足生物样品提取回收率的前提下，从经济效益最佳的角度上，最终选择乙腈作为蛋白沉淀剂，并在50℃条件下N2吹干进行后续实验。

　　本实验对PNS-BSA-MS-inj在家兔体内的药物代谢动力学特征，药物代谢动力学参数分析结果显示:PNS-BSA-MS-inj组和血塞通注射液组t1/2分别为59.350h和35.694h，延长了1.66倍;平均滞留时间(MRT0-∞)分别为57.716h和52.210h，PNS-BSA-MS-inj组比血塞通注射剂组延长了1.11倍;PNS-BSA-MS-inj组AUC0-∞为2265.702mg/(L·h-1)，是血塞通注射液组的1.16倍。说明该制剂在家兔体内具有一定的缓释作用，同时将三七总皂苷制成白蛋白微球之后，药物被包封于微球，减少了药物从关节腔向体内血液循环的渗漏，使药物长时间滞留在关节腔内，提高了药物的生物利用度，最终达到提高疗效、提高患者顺应性的目的。

　　参考文献

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　　[3]吕晶，刘孙文，杨汝贵.三七总皂苷关节腔内注射治疗膝骨关节炎的临床研究[J].临床医药文献电子杂志，2016，3(23):4673-4674.

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　　[5]郭马珑，崔宏勋，岳松涛，等.微球给药系统治疗骨性关节炎的临床治疗进展[J].深圳中西医结合杂志，2020，30(3):197-199.

　　作者：杨姗，陈汝玲，吴静澜，田孟斌，杨光锦