代谢组学技术在中药复方配伍规律研究中的应用

　　摘要：药物配伍是中医遣方用药的主要形式，中药复方是药物配伍的进一步延伸，要科学阐明中药复方疗效、优化复方配伍，单纯针对中药复方化学成分的研究不足以讲清复方配伍规律及其基本药效与作用机制。中药复方作为一个整体，应通过复方作用于机体和机体所处的整体反应来判定其疗效，进而优化复方配伍。代谢组学通过分析机体相关代谢簇和代谢网络的时序变化，阐明药味及复方的疗效，进而解析复方配伍规律。单味药是配伍的基础，药对是配伍最基本的形式，方剂是复方临床应用的最主要形式。综述了近年来代谢组学在“四气五味”“七情合和”和“君臣佐使”配伍理论中的应用研究，从性味、药对、复方等不同层次对中药复方配伍进行系统性评价，分析中药复方配伍规律，有助于指导中药复方临床用药以及新复方的研制。

　　关键词：代谢组学;复方配伍;四气五味;七情合和;君臣佐使

　　中药拥有数千年的历史传承，对于各种复杂疾病的预防与治疗具有自身独特的优势。中药复方在辨证立法的基础上，按照“四气五味”“七情合和”和“君臣佐使”等药性及配伍理论构建出复杂的“组方系统”，进而发挥多组分、多靶点的治疗作用，是对机体生化网络的整体调控[1]。然而，由于中药复方中活性成分繁杂、各成分间协同拮抗、中药复方系统与病证机体之间“系统与系统”的相互作用等因素，使得复方效应机制存在复杂的非线性特征，难以通过现代生物医学的方法科学、客观地诠释复方配伍产生的整体疗效和协同效应[2]。这严重制约了中药复方研究的深度和广度，限制了中药现代化的进程及国际市场竞争力。

　　代谢物变化作为机体终端信息表达的体现，中药复方对“方证对应”机体的疗效必然涉及对紊乱失调代谢网络的纠正和调节[3]。而代谢组学作为一门探究机体在生理或病理状态下代谢产物及代谢轨迹时序性规律的技术，采用“自上而下”的策略，借助核磁共振技术(NMR)、液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)等现代分析技术，对体液、组织、细胞中相对分子质量<1000的内源性小分子代谢物(脂质、氨基酸、核糖酸等)进行定性和定量分析，通过代谢组学数据库(HMDB、KEGG、Metlin等)对相关代谢簇信息进行整合，以监测生命系统中代谢网络的动态变化，从机体代谢角度研究疾病或药物干预导致的机体变化[4]。

　　代谢组学是一种可用于发现疾病生物标志物以及探索生命系统与药物之间复杂效应关系的有效工具。因此，其不仅能研究中药复方药效成分在体内的变化，更重要的是探究复方干预下的作用靶点和代谢网络调控机制，有助于揭示相应药物效应机制，从“系统-系统”的层次揭示中药复方的配伍规律和效应机制[5]。在保障复方疗效的基础上，在单味药、药对、复方等不同层次上探索中药复方配伍与相关靶点和效应机制的量效关系，完成对中药复方配伍的筛选和优化[6]。代谢组学与中医整体观思想相吻合，适用于评价不同复方配伍对机体的生物学效应，揭示其配伍规律。

　　近年来，代谢组学也已被广泛应用于中医药的各个领域，包括疾病研究、药物研发、药物质量控制、安全性评价等[7-9]。复方配伍是根据不同疾病阶段，不同证型，有选择地将不同功效药物两两或2种以上相结合。单味药是配伍的基础，药对是配伍最基本的形式，方剂是复方临床应用的最主要形式，而代谢组学将机体内的内源性代谢物或生物标志物群作为指标，对比分析服用不同复方配伍方案下的相应复方活性成分和机体内源性代谢物的时效变化过程，进而完成对中药复方配伍方案的筛选，确定中药复方的“量时-效”关系，明晰复方配伍原则[10]。本文主要对近年来代谢组学在中药复方配伍规律“四气五味”“七情合和”和“君臣佐使”中的应用进展进行综述。

　　1在“四气五味”理论中的应用

　　“四气五味”理论是中药药性理论的基础，是中药组方的重要依据[11]。《汤液本草》制方之法中曾提及“夫药有寒热温凉之性，酸苦辛咸甘淡之味，各有所能，不可不通也”。但早期“四气五味”理论的研究仅通过感官对中药作用人体后的反应对中药疗效进行辨别，缺乏科学、客观的诠释。基于现有的技术已知每味中药中含有几十甚至上万种化学成分，但仍无法代表其整体，而且中药经过不同炮制方法后其药效成分也会随之改变[12]，这也对科学解释中药的“四气五味”理论提出了更严峻的挑战。

　　寒与热、温与凉是两两相互对立的4种药性，《素问·五常政大论》曾提出“治热以寒，温而行之;治寒以热，凉而行之”的理论，运用代谢组学通过表征证候及中药作用后特异性生物标志群的变化，对传统“四气五味”理论中“寒者热之，热者寒之”进行诠释。王东琴等[13]以发热大鼠为对象，采用代谢组学技术研究狭叶柴胡的解热作用机制，借助GC-MS技术研究发现大鼠血浆代谢物中与发热相关的17个潜在生物标记物，并发现不同剂量狭叶柴胡均能通过酶抑制作用、神经递质等途径发挥作用，深入阐释了狭叶柴胡辛行苦泄，解表祛邪，微寒善于退热的解热机制。

　　孟宪生等[14]运用代谢组学技术研究热性中药川芎治疗寒凝证的作用机制，应用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱(UPLCQ-TOF-MS)、Markerlynx软件、主成分分析法等手段分析寒凝气滞血瘀大鼠血浆代谢物，得到了二氢神经鞘氨醇、油酰甘油磷酯酰胆碱等8种寒凝血瘀证潜在生物标志物，根据差异代谢物证实川芎可能是通过影响磷脂酰胆碱代谢途径，使血瘀症状减缓，在巩固血瘀证病因病机认识的同时，阐明热性中药川芎干预寒凝血瘀气滞证的作用机制。

　　代谢组学通过揭示中药性味与相应证候模型之间的作用，筛选出中药调节的代谢通路和潜在生物标记物，有利于正确指导中药在临床的运用，探究性味合参中药的气味配合规律。同时，同一药材也具有寒热不同的药性部位，当其作用于不同证候模型时所引起的代谢网络纠正也不尽相同。如郁金、姜黄均治疗黄疸[15]，前者治疗湿热黄疸，而后者治疗湿寒黄疸。

　　前者引起甘氨酸、苯丙氨酸、甘油、半乳糖、甘露糖和油酸亚油酸含量显著下降，而后者导致乙二酸、半乳糖、柠檬酸、苹果酸和甘露糖含量显著上升，苯丙氨酸、丙氨酸、苏氨酸和脯氨酸含量显著下降。吴宏伟[15]采用代谢组学的方法，比较了不同寒、热模型(寒湿黄疸、湿热黄疸)的差异代谢标志物，确定了不同寒热证候发病背后复杂的代谢紊乱机制，从单胺类神经递质差异代谢物的角度，对姜黄、郁金寒热药性的异同进行了一定的揭示。

　　2在“七情和合”理论中的应用

　　不同功效中药药味经过配伍形成治病诊疗的方剂，两两配伍的中药药对是中药配伍的基本单元，而源自《神农本草经》的“七情合和”理论作为中药配伍的纲领，指导着中药临床应用，与病因学的“七情”截然不同，其是指单行、相须、相使、相畏、相杀、相恶、相反7种中药相互配伍之后的不同作用效果，即对不同药物配伍后增效减毒或减效增毒进行诠释[36]。

　　药对作为2味药配伍的复方，与单味药相比，其往往具有更多的活性成分。同时，部分成分还会发生拮抗、协同，或又拮抗又协同的相互作用，这就导致单纯的单味药有效成分的简单加和，无法阐明一些中药药对的作用机制和配伍原则。而代谢组学将单味药与药对中的多种有效成分视为一个有机整体，通过对不同“方证对应”机体代谢状态的直观绘制以及潜在标记物的探索，提供了一种可视化的手段和相对定量的方法来评价中药及药对的疗效，分析起主次作用的作用靶点和代谢途径，研究药对整体协同的治疗作用，分析配伍规律，避免了单纯研究化学成分的局限性。

　　2.1单行

　　单行在《本草蒙筌》有云：“不与诸药共剂而独能攻补也”。即单味药无需配伍对某些疾病也足以发挥疗效，如人参补气固血[37]、当归活血止痛[38]、黄芩善清肺火[16]。袁子文等[38]应用代谢组学鉴定血瘀证大鼠血浆中的潜在生物标记物，识别当归干预前后显著调节的异常代谢物与紊乱代谢网络，研究发现当归通过干预血瘀证大鼠血浆中甘油磷脂代谢、花生四烯酸代谢等9条异常代谢途径，发挥其活血化瘀之功效。研究从代谢物水平分析当归活血、补血的作用机制，为当归在血瘀证的临床应用提供了理论依据。

　　2.2相须

　　相须是指2种功效相似的药物合用相互增强药效如当归-川芎[39]、麻黄-桂枝[40]。Li等[39]借助UPLC-Q-TOF-MS和模式识别技术，结合代谢组学的方法，构建了当归-川芎及其单味药对溶血性和再生障碍性贫血大鼠的代谢图谱与代谢网络。分析当归-川芎药对配伍前后对再生障碍性贫血大鼠血浆和尿液的代谢影响，发现当归、川芎、当归-川芎药对均能通过回调差异代谢物，干预硫胺素代谢、鞘磷脂代谢等方式发挥其补血、活血、祛瘀的功效，揭示了当归、川芎和当归-川芎不同的造血功效和作用机制，深入阐明了当归-川芎协同互补的养血、活血作用，为全面了解血虚症方剂的配伍规律提供了依据。

　　2.3相使

　　相使是在治疗目的相同的前提下，功效不同的2种药物相互配伍，一味药为主，另一味药为辅，主辅结合以增主药功效或降低不良反应。如黄连-黄芩[41]、麻黄-石膏[42]。Li等[43]采用UPLC-Q-TOF-MS技术分析当归-红药对血虚证大鼠血浆和尿液中代谢物的调节作用，发现单味药和药对对血虚证大鼠花生四烯酸代谢途径中的潜在生物标志物有不同程度的干预作用，并且药对组调节作用最强，从机体代谢变化的角度阐述当归、红花、当归-红花的补血作用及机制，通过代谢组学的方法进一步阐释了当归-红花相使配伍的合理性。

　　2.4相畏、相杀

　　相畏相杀，2味药配伍，一味药牵制另一味药从而减毒或消除不良反应。其中起制伏作用的药味为相杀关系，受制药味为相畏关系。如甘草-雷公藤[44]、附子-甘草[45]。Dong等[46]为研究川乌毒性诱导的生化表型扰动和代谢网络紊乱，采用UPLC-Q-TOFMS技术进行尿液代谢组学分析，鉴定出17个与川乌毒性相关的潜在生物标志物，并评价甘草、白芍、干姜联合用药的解毒效果，发现干姜、白芍和甘草均能不同程度干预戊糖和葡萄糖醛酸的相互转化以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢等代谢途径，回调川乌毒性生物标志物的水平。表明代谢组学对于评价中药毒性和寻找解毒配伍具有重要意义。

　　2.5相恶、相反相恶，“相恶者，夺我之所能”，即配伍后药味减效甚至失效。如黄芩恶生姜[47]，两者配伍减弱黄芩的功效。相反，两药合用产生不良反应，如甘遂-甘草[48]、昆布-甘草[49]。孙润彬等[49]采用GC-MS方法对大鼠血清中内源性代谢物分析发现昆布、甘草与昆布-甘草给药均对代谢有明显影响，且昆布-甘草与昆布对机体代谢影响相似，通过对肾脏病理组织切片发现联合给药较单味药给药造成更严重的肾脏组织病理异常。

　　从代谢组学的角度科学地阐释了“藻戟芫花俱战草”的配伍禁忌[49]。代谢组学从体内代谢物层次分析各药对配伍前后机体内代谢产物、代谢网络的差异，揭示药物七情配伍之间的功效特点，进而客观阐明“七情合和”理论，有利于解释中药药对的干预机制。

　　3在“君臣佐使”理论中的应用

　　方剂配伍是按照“君臣佐使”的主次原则，将功效不同的群药整合成一个严密有效的有机整体，从而提高药物疗效，减轻不良反应。“君臣佐使”理论与“七情合和”理论有着紧密的联系，是七情配伍的延伸与拓展[54]。目前，对中药复方配伍规律的揭示多采用复方拆方的方法，将复方拆去一味或几味中药以观察药效变化[55]。该方法虽然一定程度上阐明了配伍的合理性，但因为方剂成分复杂且具有时效性，以及机体与药物的相互作用，使得传统的复方拆方方法破坏原方剂配伍产生的整体性[56]。

　　而代谢组学通过跟踪和揭示中药复方配伍过程中机体相关代谢标志物的组成变化，研究机体失调代谢网络的纠正和调节过程，借助代谢组学的方法将不同配伍复方的作用靶点、途径、调控网络等生物学信息相整合，从宏观整体参数和微观特异性参数相结合角度入手，比较复方中各功能组分(君、臣、佐、使)与复方协同作用的差异，揭示不同功能组分配伍前后的相关靶点与作用途径，探究其药效物质基础，明确中药复方配伍产生的不同药效作用和代谢网络调节，寻找最佳中药复方配伍方案，尽可能挖掘复方配伍中“药味-量-时-效”规律。

　　君药可理解为是单行的延展应用，即主病之谓君。如独参汤补气固脱[37]。戴伟东等[58]基于超快速液相色谱-离子阱-飞行时间串联质谱(UFLC-ITTOF-MS)的代谢组学方法对过度疲劳模型大鼠血浆进行分析，评价了通心络和人参对过度疲劳的干预作用，通过对与过度疲劳相关的生物标记物进行综合分析，从代谢网络中发现人参与通心络对大部分差异代谢物均具有显著干预作用，但对溶血磷脂酰胆碱的调节作用相反，通心络调节更加全面，阐明了君药、复方对过度疲劳大鼠的不同干预作用，发现君药人参性能强、药力大的特点，但仍弱于组方的疗效，进一步证实组方配伍的合理性。臣药更侧重于相须相使的配伍运用，即辅君药，兼治病。如麻黄汤中，麻黄-桂枝的君臣相须[71];黄连解毒汤中，黄连-黄芩的君臣相使[72];四逆汤中附子回阳救逆，干姜温中散寒，二者君臣配伍，奠定方之基石。

　　Zhou等[59]采用代谢组学结合计算机系统分析和RNA反转录-cDNA聚合酶链式扩增结合技术(RT-PCR)，定量评估不同配伍四逆汤对心力衰竭大鼠的作用功效并阐明其作用机制，研究发现君药能显著逆转紊乱的6条代谢通路，臣药能显著逆转紊乱的5条代谢通路，其中亚油酸代谢、鞘脂代谢和花生四烯酸代谢为共同调节的通路，附子-干姜配伍后能显著逆转苯丙氨酸代谢、色氨酸代谢、三羧酸循环等10条紊乱的代谢通路，配伍后代谢调节更为广泛，通过构建复方-药味-代谢途径的代谢网络，对“附子无干姜不热”的君臣协同增效配伍理论进行了一定的科学诠释，进一步为临床上四逆汤的遣方用药提供了理论依据。佐药乃是相须、相使、相畏、相杀的灵活运用，即佐助药，助长君臣药味的治疗作用。如肾气丸中配伍桂附增强熟地功效[73]，佐制药，牵制君臣药味不良反应，如麻黄汤、麻桂畏炙甘草[71]。

　　使药是单行的特殊应用，即用以调和药味，引导诸药，如补中益气汤中的升麻、柴胡引导诸药[60]。Wu等[61]以血清代谢谱的整体扰动为指标，采用UPLC-Q-TOFMS血清代谢组学的方法，评价血瘀证模型大鼠血清代谢物异常变化以及当归四逆汤和各组分活血化瘀的配伍效果，发现去除佐使药后无法调节甘油磷脂代谢途径，通过去除功能组分以保持部分协同作用的方法，揭示当归四逆汤的整体干预作用以及各组分对活血化瘀功效的贡献。

　　4结语与展望

　　方剂的组成是根据机体的病证、病机、病因等因素，选取不同性味的中药，综合运用七情合和的配伍关系，对不同药味进行协同或拮抗调节，以实现调偏制毒、增效减毒的功效[71-74]。同时，按照君臣佐使的主次原则，将群药融合成一个协调有序的有机整体。

　　因此，复方具有2个典型特点：一是方中各药味可能针对患者的不同环节发挥作用;二是方中各药味地位不同，即君臣佐使之分。只有明晰各药味对整个复方的贡献，才能更好地阐明传统方剂治疗疾病的优势，也有利于治疗各种复杂疾病[75]。

　　而代谢组学研究中药复方配伍特点拥有以下优势：

　　(1)代谢组学检测的物质种类比其他组学所测种类少，无需建立全基因测序的庞大数据库;(2)代谢物在不同的生物样本中种类基本一致，其研究技术相对更通用，检测结果更简洁明了;(3)代谢组学整体、无创、动态的特点能够更好的反应不同中药配伍时对“方证对应”机体的修复和调节作用;(4)代谢物能有效地反映出中药干预下基因和蛋白表达的微小变化，易于检测。中医治病的基本原则在于“证千变，药亦千变”，而代谢组学通过检测代谢网络扰动情况，定量评估不同配伍方案对发挥药效的特定机体内环境的影响，既能揭示“证”的实质，又有助于揭示各药物配伍前后的作用机制。尽管代谢组学在中药复方配伍研究中有较大的优势，但仍面临着许多挑战。

　　首先，不同造模方式会引起不同代谢物变化。其次，同种药材的不同药用部位，不同配伍比例，不同炮制方法等也会引起不同的代谢物调节。最后，代谢组学研究筛选得到的代谢物和代谢通路数量较少，影响检测结果因素较多，易出现假阳性、假阴性等情况。但代谢组学能与多学科(中药药理学-网络药理学-肠道菌群等)相结合，从多角度(方-证-效)、多层次(性味-七情和合-君臣佐使)，建立中药复方配伍的研究方法，在保证中药复方整体疗效的基础上，解析各组分对全方的贡献，挖掘中药复方配伍规律内涵，为优化复方的临床应用提供了参考，也为今后创造新的中药复方提供了思路。

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　　作者：王杰1，隗鑫1，陈威2，吕燕慧1，魏艳平1，祖先鹏2*，张秀云1