蛋白质磷酸化对宰后肉品质影响研究进展

　　摘要：畜禽肌肉在宰后变为可食肉的过程中，需要经过一系列的生化变化直到成熟，其中蛋白质磷酸化反应作为一种蛋白质的动态调控机制，几乎调节每一个主要的生物过程，是生物界广泛的翻译后修饰之一。因此研究蛋白质磷酸化与宰后肌肉的关系，有助于肉类食品行业的发展。本文以介绍蛋白质磷酸化开始，讨论了磷酸化蛋白质检测技术的进步，总结宰后肌肉中会发生磷酸化的蛋白质及影响因素，从蛋白质磷酸化反应与宰后肉的嫩度、肉的色泽和保水性三个方面的研究入手综述了蛋白质磷酸化反应对肉品质的影响，以及食盐与氨基酸在该过程中的应用， 并对蛋白质磷酸化反应在肉品品质中的研究做出了展望。

　　关键词：蛋白质磷酸化;肉质;肉色;保水性;食盐;氨基酸

　　在日常生活中，人体维持营养均衡的膳食不仅需要绿色的水果蔬菜，肉及肉制品的摄入也是必不可少的。果蔬可以为人体提供维生素、矿物质和水分，但是供能营养素(蛋白质、脂肪)主要来源于肉类食品，除此之外，肉类食品中也含有维生素和微量元素。我国作为农业生产大国，畜牧业已随着社会经济的发展越来越壮大，肉及肉制品的供给从短缺的状况到能够满足人们日常营养膳食补充的需要[1]。作为全世界最大的肉制品生产和消费国，我国肉制品的年产量占全球总量的 1/4[2]。久而久之，人们对于肉及肉制品从数量的需要转变成了对质量的关注。肉及肉制品中含有丰富的、结构复杂的蛋白质大分子，以氨基酸为单位，构成元素有碳、氢、氧、氮、硫等，部分蛋白质分子还含有铁、碘、磷、锌元素等。蛋白质的功能特性(如保水性、凝胶特性及乳化性)，会对肉的品质产生显著的影响[3]。

　　肉的品质(主要包括嫩度、颜色、风味、保水性等)除了与宰前动物的品种、年龄、健康状况、肌肉部位、管理有关，也与宰后时间以及宰后环境(温度、湿度等)有关，畜禽机体被宰杀后，肉并不是最终形态，肌肉内的生理生化代谢活动仍在继续，经历这段过程才能使畜禽内部肌肉成熟变为可食肉。在各种生命体的动态调控机制中，蛋白质翻译后修饰(protein translational modifications，PTMs)的作用显著，真核生物中大约有三百多种修饰种类，包括蛋白质乙酰化、泛素化、甲基化和磷酸化等，翻译后修饰的蛋白质不论是在结构、功能特性、调节方式还是专一性方面，整体上都经过了有效的正向调整[4,5]。蛋白质修饰不仅影响蛋白质的稳态，还能建立新的细胞功能，是复杂的细胞信号传感和转导网络的重要组成部分，这些不同的 PTMs 对受影响的蛋白质及其参与的细胞过程可能产生许多不同的结果[6]。

　　而蛋白质磷酸化(protein phosphorylation)是其中最常见的，是一种可逆的、快速的信号转导和蛋白活性调控手段，可以调节多种生命活动，在特定的时间内哺乳动物细胞中大约有三分之一的蛋白质是经过磷酸化修饰的[7,8]，在调节细胞分裂凋亡、介导细胞信号的传导、复制DNA、表达和分化基因等过程中起着至关重要的作用，并且可以改变酶活性和其他生物活性[9]。在宰后肌肉的生理生化活动中，蛋白质磷酸化对成熟肉的品质有一定的影响，探究其影响的作用机制，可以将结果有效地运用到肉及肉制品的加工工艺中，生产美味营养又健康的肉类食品。

　　本文从介绍蛋白质磷酸化的概念和检测分析技术出发，对宰后肌肉中会发生磷酸化翻译后修饰的蛋白质和影响磷酸化水平的多种因素进行了总结;然后围绕蛋白质磷酸化与宰后肌肉的嫩度、色泽与保水性的研究结果进行阐述;食盐是蛋白质磷酸化水平的影响因素之一，但在食品减盐的大背景下，碱性氨基酸在肉类食品加工中具有多项优点，通过氨基酸对宰后肌肉中蛋白质磷酸化的影响，为肉制品低盐加工提供理论支持。

　　1 蛋白质磷酸化的介绍

　　20 世纪 50 年代， Fischer 和 Krebs 两位科学家在研究糖原的新陈代谢调控时发现了蛋白质磷酸化反应。蛋白质磷酸化是指，在蛋白激酶的催化条件下，将腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)或三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP) γ 位上的磷酸基团，转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，较多发生在丝氨酸(serine, Ser)、苏氨酸(l-threonine, Thr)或酪氨酸(tyrosine, Tyr)等残基侧链的羟基上[10,11]。蛋白质磷酸化反应是动态的、可逆的，因此控制该过程不仅需要一个蛋白激酶(proteinkinases, PK)，还需要一个蛋白质磷酸酶(proteinphosphatase, PP)，两者发挥各自的作用，以实现蛋白质的磷酸化或者去磷酸化的调控，进而达到研究的目的。

　　1994 年，Williams 和 Wilkins 学者联系蛋白质(protein)与基因组(genome)两个概念，提出蛋白质组(proteome)一词，指“由一个细胞或一个组织基因组所能够表达的全部蛋白质”[13]。在肉品科学领域内，蛋白质组学的研究使科研人员能够更好地了解肉品质与不同品种[14]、基因型差异[15] 、持水的能力[16]以及成熟老化[17]的关系。蛋白质组学是一个关键的工具，以揭示肌肉蛋白质水平在宰后发生的生物化学变化。蛋白质组学可以检测畜禽宰后发生的蛋白质翻译后修饰，可以对细胞或组织中蛋白质磷酸化修饰的情况有较为整体的观察，因此逐渐产生了磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)这一新概念[9]。

　　此后，在磷酸化蛋白质组学的知识基础上，生物学家们增加了新的研究思路，能够更加全面地研究磷酸化蛋白质在细胞或组织中的作用，研究蛋白质磷酸化的发展上升了一个台阶。磷酸化蛋白质研究和发展过程中的困难主要在于检测和分析，发生磷酸化修饰的蛋白质数量少，需要高精密度和高专一性仪器才能检测出结果。即使磷酸化修饰的蛋白质分子的表达量相对较高，但对蛋白质的磷酸化修饰部分的分析依然困难，这是因为数据证明，磷酸化蛋白质的部分仅占该全蛋白质总量的 10%[18]。磷酸化蛋白质组学研究的关键进展有赖于磷酸化蛋白质的识别和鉴定技术。

　　常见检测磷酸化蛋白质的方法可以分为三类，磷酸化蛋白质的富集、磷酸化蛋白质分离技术以及磷酸化蛋白质的定量和位点分析技术，磷酸化蛋白质的富集有助于检测仪器发现和鉴定，如免疫共沉淀法利于磷酸化蛋白与抗体结合性强有效富集磷酸肽，分离磷酸肽后可以独立检测，减少其他物质的干扰，定量分析和位点测定可以对全蛋白质组进行研究从而找到动态调控中的目标磷酸化蛋白质和关键作用位点。蛋白质磷酸化检测技术是得出相关实验结果必要的基础，技术的进步随着实验所需和科技发展不断发展，分析方法主要采用色谱、质谱技术与其他手段联用，各种方法均有各自的特点与局限性，根据具体的实验需求选择最佳的检测技术。

　　2 磷酸化蛋白

　　基于质谱的磷蛋白组学研究表明，很大比例的细胞蛋白(超过 6000 种蛋白)可以被磷酸化[31]。肌肉中的蛋白质含量和种类多，在引发蛋白质磷酸化影响肉品质相关的思考后，科研人员开始了对肌肉内发生磷酸化或去磷酸化的蛋白及影响因素的研究。肌钙蛋白、肌球蛋白轻链和肌动蛋白等蛋白质，都会发生磷酸化修饰，肌钙蛋白和钙蛋白酶抑制蛋白等的磷酸化可以降低蛋白的降解。James 等人[32]发现骨骼肌肌球蛋白轻链激酶可磷酸化肌球蛋白调节轻链，改变肌球蛋白的结构。同样，Huang 等人[33,34]通过实验表明，磷蛋白主要作为相关酶参与糖代谢活动，其余参与宰后应激反应、磷酸肌酸代谢，磷蛋白磷酸化水平的变化，会影响宰后肌肉 pH 下降速率。

　　Chen Li 等人[35]对宰后羊肌肉中肌浆蛋白磷酸化水平与糖酵解率的关系进行了研究，发现糖酵解速率与肌浆磷酸化水平呈负相关，并影响宰后早期肌肉 pH 值的下降。Li Zheng 等人[36]的实验研究结果是肌原纤维蛋白的磷酸化水平的降低，会加速肌原纤维的断裂。肌球蛋白重链、肌动蛋白和原肌球蛋白在宰后肌肉中降解困难，去磷酸化增强了部分肌原纤维蛋白的降解，推测出蛋白质磷酸化和去磷酸化水平的变化可能与宰后肌肉的嫩化密切相关。Li Zheng[37]也通过实验表明肌原纤维蛋白和 μ-钙蛋白酶可发生磷酸化，影响肌肉内肌原纤维蛋白被 μ-钙蛋白的降解，表明蛋白质磷酸化在宰后肉的嫩化过程中发挥了重要作用。

　　蛋白质磷酸化会对肉的品质产生影响，研究影响蛋白和酶磷酸化的因素可为宰后肉加工提供可靠信息。此前有研究表明冰温(冰点以上、0℃以下的温度)储藏对牛肉的嫩度有影响[39]。张艳等[40]测定了宰后羊肉分别在冰温和冷藏条件下，肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的磷酸化水平，即使冰温条件下两者的磷酸化水平变化趋势相反，但磷酸化水平均低于冷藏处理组。张彩霞等人[41]也研究了羊肉肌浆蛋白和肌原纤维蛋白的磷酸化水平分别在三个温度(-1°C、4°C 和 25°C)下的变化，腌制温度能够正向调控肌浆蛋白的磷酸化水平，负向调控肌原纤维蛋白的磷酸化水平。Li Xiao 和 ZengXiaoming 等人[42,43]也研究了宰后猪肉肌原纤维蛋白和肌浆蛋白磷酸化水平在不同季节时的变化，该影响本质上是通过温度的变化改变糖酵解速率等间接起作用。

　　除了温度的影响外，Li Chunbao 等[44]人研究了电刺激(electrical stimulation, ES)的处理方式对牛肉肌浆蛋白和肌原纤维蛋白磷酸化的影响，结果表明电刺激存在瞬时影响肌原蛋白的磷酸化水平的改变，但是肌浆蛋白磷酸化水平在 3h 后才会表现出受到了显著影响。酶本身也会影响蛋白质磷酸化，Cao Lichuang 等人[45]发现肌球蛋白轻链激酶和肌球蛋白轻链激酶抑制剂可调节肌球蛋白调节轻链在 Ser17 位点的磷酸化状态，影响肌动球蛋白的解离，调节肌肉收缩从而达到改善肉质的目的。

　　3 蛋白质磷酸化与肉品质的关系

　　蛋白质磷酸化反应自发现以来，更多研究应用在医学、生物化学等方面，而对蛋白质磷酸化与肉品关系的探索比较缺乏。近年来，蛋白质磷酸化的重要性引起了更多领域专业人员的关注，使人们对其与宰后肌肉品质(主要是嫩度、颜色、保水性)的关系产生了兴趣，并展开了不少的研究。

　　3.1 嫩度肉质对消费者满意度和吸引

　　他们再次购买非常重要，对肉类的总体满意度首先与嫩度有关[46]。已有研究证明肉的嫩度受屠宰前因素(如品种、年龄、性别、处理)和屠宰后因素(如胴体处理、调理和老化)的单独或共同影响[47]。畜禽宰后肌肉嫩度的变化会经历能量的代谢，糖酵解启动产生ATP，直到糖酵解酶失活或肌糖原耗尽结束，持续的糖酵解作用会使乳酸含量逐渐增加，最终引起肌肉内 pH 的下降。糖酵解是宰后肌肉最主要的供能方式，糖酵解作用过快、过度或不足分别会产生苍白、柔软、渗出 ( pale, soft and exudative，PSE)肉和黑色、坚硬、干燥 (dark, firm and dry，DFD)肉[48]。

　　Li Chen 等人[49]在实验中用蛋白激酶或磷酸酶抑制剂处理绵羊肌肉，蛋白质磷酸化水平有显著变化，并且测定了 pH 值和乳酸含量，数据表明高蛋白质磷酸化水平，加快了糖酵解的速度。肌肉结构(结缔组织)和生化特性(肌原纤维和细胞骨架蛋白的蛋白分解)是影响牛肉嫩度变异的主要因素[50]。屠宰前应激对肉质有不良影响，可能导致牛产生 DFD 肉。Franco 等[51]研究探讨了屠宰前应激对牛胸最长肌中蛋白质组的变化。采用 2-DE 和 MS 结合分析，共有 7 种差异结构收缩蛋白和 3 种差异代谢酶。此外，2-DE 结合磷酸蛋白特异性荧光染料 Pro-Q DPS 发现，高磷酸化的快速骨骼肌球蛋白调节轻链 2 亚型在肌肉转化为 DFD 肉的过程中经历了最显著变化。D’Alessandro 和 Huang Honggang等人[52-53]发现，宰后肌肉蛋白质的磷酸化水平会发生显著变化，但总蛋白质磷酸化水平相对稳定。

　　蛋白质磷酸化是影响宰后肌肉向可食肉转变的一个关键因素，不仅调节糖酵解酶活性，同时也调节原肌球蛋白等结构的稳定性。陈立娟[54]以羊肉为实验对象，发现高嫩度组的宰后羊肉中肌原纤维蛋白整体磷酸化水平低于低嫩度组，且鉴定到的磷酸化蛋白质大多与肌节功能调节、糖酵解、肌肉收缩有关，表明蛋白质磷酸化可通过调控这些环节间接影响宰后肌肉嫩度。宰后蛋白质的水解在影响嫩度方面起着关键作用。

　　肌浆蛋白磷酸化可调节 pH 下降速率，影响μ-钙蛋白酶活性，进而影响蛋白质的水解，最终改善肉质[55]。刘满顺[56]以陕北白绒山羊的背最长肌和胸腹肉作为实验材料，经过检测和分析技术得到 2125 条磷酸化肽段和 750 个磷酸化蛋白，超过五分之四的磷酸化蛋白质主要参与代谢过程、应激反应、信号传导和生物过程调节，具有催化酶活性的功能。在肌肉蛋白结构中，小热休克蛋白(small heat shock proteins, sHSPs)可以模拟肌动蛋白，与肌动蛋白-肌动蛋白结合位点有效结合，能够抑制肌动蛋白的聚合， sHSPs 这种对肌动蛋白聚合的抑制作用受其磷酸化状态的影响，因此有观点认为 sHSPs 可以通过其磷酸化水平的变化调节平滑肌收缩而改善肉的嫩度[57]。WengKaiqi 等人[58]对生长快速和慢速的肉鸡进行了其肉质差异产生的机制探讨，慢速肉的红色和黄色度较高，剪切力、宰后 24h pH 和蛋白质含量较高，但肌内脂肪含量较快速肉低。此外，基于磷酸化蛋白质组学分析，上调磷酸化的肌原纤维蛋白导致更大的纤维，这有助于改善肉质。糖酵解酶、磷酸化酶激酶和钙相关蛋白的磷酸化蛋白显著下调，降低了肉的酸度。这些磷蛋白为鸡肉品质的改良提供了重要的信息。

　　3.2 颜色虽然肉类的颜色并不是其安全性和质量的可靠预测者，但这并不能避免消费者对其有特定的预期，消费者经常将其作为肉类健康程度的指标，以此作为决定是否购买的基础。因此，肉的颜色一直是世界范围内肉类研究人员关注的重要的品质属性之一[59]。

　　4 食盐与蛋白质磷酸化

　　日常生活中肉制品加工过程中会添加多种外源物，食盐、糖较为常见。科学工作者们研究了食盐与蛋白质磷酸化的关系;全球食品减盐大背景下，为了达到减盐保质的效果，对食盐替代物进行了充分的试验，氨基酸在肉制品加工过程中通过影响蛋白质磷酸化水平从而改善肉质的作用联系正在被挖掘。

　　5 结语

　　蛋白质磷酸化的检测技术通常无法采取一种就可以达到检测目的，暴露的缺点与其他方法联用能有所弥补，发展磷酸化蛋白质的检测新技术和最佳的联用组合仍需要一定时间的探索。畜禽肌肉中所含蛋白种类丰富，与磷酸化有联系的蛋白结构特性及其动态变化的位点需要更多试验来发现。蛋白质磷酸化动态调控是否与宰后肉品质的风味、多汁性等指标有关仍有待研究。在肉与肉制品加工过程中会添加许多外源物，蛋白质磷酸化影响肉制品的成熟发展，除食盐与氨基酸以外的添加物是否与蛋白质磷酸化有关并改善肉质，还需研究证明，从而为肉品行业提供更多有价值的理论依据。

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　　作者：王文琪，张雅玮*，李加慧，彭增起