颗粒粒径对荷叶不溶性膳食纤维结构理化及感官品质的影响

　　摘 要：为筛选荷叶不溶性膳食纤维(lotus leaf insoluble dietary fiber，LIDF)作为高纤维食品辅料开发的最佳粒径，对比分析了 4 种颗粒粒径 LIDF 的结构、理化及感官品质。通过扫描电镜、傅里叶红外光谱及 X衍射光谱分析发现酶解后 LIDF 表面出现孔洞，粒径越小荷叶内质网格状纤维暴露越多，LIDF 具有纤维素特征官能团结构，粒径越小纤维素结晶度指数越低。在研究的颗粒粒径范围内随着 LIDF 粒径减小，LIDF总黄酮、总多酚含量减小，不溶性膳食纤维含量以及体外吸附特性增加，粉体 a*值和 b*值增加，产品感官评分增高。综合多方面指标评价出 D50 58.35 μm LIDF 作为高纤维食品辅料的开发潜力较好。

　　关键词：荷叶;不溶性膳食纤维;颗粒粒径;结构分析;理化特性

　　膳食纤维具有调节血糖、降低血脂、预防肥胖、调节肠道菌群等功效，已成为消费者青睐的功能性食品原料。从果皮、蔬菜、芦笋叶、枸杞叶和桑叶等农副产物中提取的膳食纤维，纤维组成多样化且含有植物多酚等抗氧化成分，被誉为抗氧化性膳食纤维，具有更好的功能特性[1, 2]。此类膳食纤维来源广泛，合理开发能较大提高农产品的附加值，受到了较多研究者的关注[3]。在逐渐深入的研究中发现不溶性膳食纤维制备过程中较多因素直接影响纤维的结构及其组分，进一步影响其理化功能特性[4]。

　　尤其对于纤维结构相对致密的原料，前期制备过程中的颗粒粒径大小更加至关重要[5, 6]。但目前在很多膳食纤维的研究与开发中颗粒粒径对功能特性的影响仍然被忽略。荷叶为睡莲科植物莲的干燥叶，《本草纲目》记载“荷叶服之，令人瘦劣”，在中国常作为减肥、瘦身、降脂的药品或功能性食品的原材料。荷叶富含多酚类物质和膳食纤维，符合天然优质膳食纤维的来源条件[7]。

　　同时消费者对荷叶的认可度高，荷叶属于药食兼用资源可作为普通食品的辅料使用，开发门槛较低，荷叶膳食纤维作为高纤维食品辅料的可开发潜力较大。膳食纤维大多口感粗糙，为降低对食品感官品质带来的不良影响，膳食纤维常经粉碎甚至微粉化处理后再添加到食品中，一般来说膳食纤维颗粒粒径越小感官评价越高。同时有研究发现颗粒粒径过大或过小都不利于不溶性膳食纤维的功能特性。本文对比分析 4 种不同颗粒粒径荷叶不溶性膳食纤维(lotus leaf insoluble dietary fiber，LIDF)的结构、功能成分含量、体外吸附特性和食用感官品质，筛选 LIDF 作为高纤维食品辅料适宜的颗粒粒径，为后期荷叶膳食纤维的深入研究提供参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　干荷叶，购于湖南振兴中药有限公司，为采摘刚舒展开、微微卷边的嫩荷叶，无熏硫，自然晾干而成;芦丁、原儿茶酸(AR，上海跃腾生物技术有限公司);α-淀粉酶(BR，CAS9001-19-8)、淀粉葡萄糖苷酶(BR，CAS 9032-08-0)、蛋白酶(BR，CAS 9068-59-1)(上海源叶生物科技有限公司);三羟甲基氨基甲烷(BR)、2-(N-吗啉代)乙烷磺酸(AR)、福林-酚(BR)、胆固醇(AR)、氯化钠(AR)、冰乙酸(AR)(国药集团化学试剂有限公司);总膳食纤维测定试剂盒(爱尔兰安诺伦生物科技有限公司)。

　　1.2 主要仪器与设备FW100 粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);Bettersize2600E 激光粒度分布仪(丹东百特仪器有限公司);EVO18 扫描电子显微镜(德国蔡司公司);NicoletiS5 傅里叶变换红外光谱仪(赛默飞世尔科技公司);D8 advance X 射线衍射仪(德国布鲁克 AXS 公司);TDZ5-WS 型台式低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司);UV 2450 紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限公司);CS-820N 色度仪(杭州彩谱科技有限公司)。

　　1.3 试验方法

　　1.3.1 LIDF 的提取参考 GB5009.88-2014 提取 LIDF，方法略有改动。干荷叶经干法剪切粉碎不同时间筛分得到 100~150 目、150~200 目、200~250 目以及 250 目以上 4 种颗粒粒径的荷叶粉。分别取此4 种荷叶粉10.000 g 置于1 000 mL 锥形瓶中，加入500 mL MES-TRIS缓冲液(0.05 mol/L，24 ℃下 pH 8.2)并搅拌分散，加入 0.5 mL α-淀粉酶(10 000 U/mL)95 ℃水浴酶解 35 min，冷却至 60 ℃加入 1 mL 蛋白酶(400 U/mL)60 ℃水浴酶解 30 min，调节 pH 至 4.5，加入 1mL 淀粉葡萄糖苷酶(3 000 U/mL)60 ℃水浴酶解 30 min，90 ℃水浴灭酶 10 min 后，4 000r/min 离心 15 min 取沉淀，置于恒温干燥箱 80 ℃下烘至恒重得到 100~150 目、150~200 目、200~250 目以及 250 目以上 4 种颗粒粒径荷叶粉制备的 LIDF，后续分别用 LIDF-A、LIDF-B、LIDF-C、LIDF-D 表示。1.3.2 LIDF 粒径分布称取适量的 LIDF 置于 LS-POP 激光粒度仪样品槽中，用蒸馏水作为分散剂湿法测定LIDF 粒径分布。

　　1.3.3 结构分析

　　1.3.3.1 显微结构观察将 LIDF 粉末用胶带固定后表面喷金，在扫描电子显微镜下观察其微观结构。

　　1.3.3.2 红外光谱分析称取LIDF 2 mg与KBr粉末200 mg于研钵中，混匀并充分研磨，制片。在400~4 000 cm-1，扫描次数 32 次，扫描分辨率 4 cm-1，进行红外光谱分析。

　　1.3.3.3 X 衍射分析LIDF 的 X 射线衍射分析按参考文献[8]的方法进行操作。扫描参数为靶：Cu-Ka;步宽：0.02°;扫描速率：3(°)/min;扫描范围 2θ 为 5°~50°。参照参考文献[9]中 Segal 的公式计算结晶度指数(crystallinity index，CrI)。

　　1.3.4 LIDF 功能成分含量的测定

　　1.3.4.1 LIDF 中不溶性膳食纤维含量的测定按总膳食纤维测定试剂盒的方法测定 LIDF 中不溶性膳食纤维含量。

　　1.3.4.2 LIDF 中总多酚和总黄酮含量的测定称取 LIDF 0.500 g 置于 250 mL 锥形瓶中，加入 20 mL 70%乙醇溶液，超声功率 60%、60 ℃下超声 50 min，5 000 r/min 离心 15 min 取上清液。重复以上步骤 1 次，合并 2 次上清液，用 70%乙醇溶液定容至 50 mL，作为 LIDF 总多酚、总黄酮提取液待测。

　　LIDF 总多酚含量的测定按参考文献[10]的方法测定。分别吸取 1、2、3、4、5 mL 0.1 mg/mL 芦丁标准溶液置于 10 mL 具塞试管中，加 70%乙醇至 5 mL，加 5%亚硝酸钠溶液 0.4 mL，摇匀后静置 6 min;加 10%硝酸铝溶液 0.4 mL，摇匀后静置 6 min;加 4%氢氧化钠溶液 4 mL，70%乙醇定容，摇匀后静置 15 min，立即在512 nm 波长处测定吸光度。以芦丁标准溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。取 0.5 mL LIDF 提取液置于 10 mL 具塞试管中，后续操作同前。根据标准曲线计算 LIDF 总黄酮的含量。1.3.5 LIDF 体外吸附特性的测定

　　1.3.5.1 持水性、持油性的测定按照参考文献[11]的方法略有改动。称取 LIDF 0.500 g 置于 50 mL 离心管中，加入 10 mL蒸馏水或大豆油混合均匀。置于漩涡振荡器上震荡 30 s，每震荡一次间隔 10 min，3 次后10 000 r/min 离心 15 min，将上层溶液倾倒出称重。

　　1.3.5.2 阳离子交换能力的测定按照参考文献[12]的方法测定 LIDF 的阳离子交换能力。

　　1.3.5.3 对胆固醇吸附能力的测定按照参考文献[13]的方法测定 LIDF 对胆固醇的吸附能力。

　　1.3.5.4 对胆酸钠吸附能力的测定

　　按照参考文献[14]的方法略有改动。分别量取 100、200、300、400、500 μL 1 mg/mL 胆酸钠标准溶液置于10 mL具塞试管中，用水补充体积至1 mL，加入6 mL 45%硫酸混合均匀，加入 1 mL 0.3%糠醛，65 ℃水浴加热 30 min，冷却至室温，在 620 nm 波长处测定吸光值。以胆酸钠标准溶液浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。称取 LIDF 0.500 g 置于250 mL 锥形瓶中，加入 50 mL 0.15 mol/L NaCl 溶液(含 0.100 g 胆酸钠)，调节 pH 值至 7.0，37 ℃、150 r/min 恒温振荡 2 h，5 000 r/min 离心 15 min。取 0.3 mL 上清液置于 10 mL 具塞试管中，采用上述糠醛比色法在 620 nm 波长处测定吸光值，根据标准曲线计算上清液中胆酸钠的含量。

　　1.3.6 LIDF 感官品质分析

　　1.3.6.1 色度测定

　　[15]采用色度分析仪测定样品色泽。色度值用 CEL L*、a*、b*值表示，其中，L*表示明亮度(0 为黑，100 为白);a*表示红绿度(a*>0，表示红色程度;a*<0 表示绿色程度);b*表示黄蓝度(b*>0 表示黄色程度，b*<0 表示蓝色程度)。每个样品重复测定 9 次。1.3.6.2 LIDF 食品感官评定为全面评价 LIDF 颗粒粒径对食品感官的影响，采用常规基础工艺，制备 LIDF 液体食品(饮料)、半固体食品(米糊)、固体食品(饼干)三种类型的 LIDF 食品。

　　具体工艺如下，将 3 g LIDF 溶入 100 mL 0.2%结冷胶溶液中，搅拌均匀制成颗粒均匀悬浮的 LIDF 饮料;将 3 g LIDF 与 17 g 熟化米粉混合均匀，加入约 100 mL 沸水冲泡，搅拌均匀制成 LIDF 米糊;将 3 g LIDF 与 97 g 面粉混合均匀，加入 15 g 植物油、0.5 g 泡打粉、0.5 g 小苏打、30 g 鸡蛋清混合均匀后揉捏成团，冷藏 20 min 擀面压型，置于上、下火均为 160 ℃的烤箱中烘烤15 min，冷却后制成 LIDF 饼干。工艺中不添加糖酸调味，重点关注因颗粒粒径对感官品质的影响。选取 10 名品评员，对产品口感、滋味、外观、香气的影响进行评分，评分标准如表 1，满分 100 分。

　　1.4 数据分析

　　每个试样重复 3 次，数据采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，结果采用平均数±标准差表示。结果分析与讨论2.1 LIDF 的粒径分布原料干荷叶为采摘刚舒展开微微卷边的嫩荷叶自然晾干，易于粉碎。预实验发现未过100 目筛网的荷叶粉，颗粒较大、口感粗糙，不适合作为辅料用于食品开发。故研究以 100目以上筛分得到的 4 种颗粒粒径荷叶粉为原料提取 LIDF，其粒径分布及比表面积如表 2 所示。LIDF-A、LIDF-B 的 D50 高于 100 μm，分别为 171.53、100.37 μm;LIDF-C、LIDF-D 的D50 低于 100 μm，分别为 58.35、21.21 μm，同时 LIDF 比表面积随颗粒粒径减少而增加。4种 LIDF 的颗粒粒径分布有一定的区分度，结合后续实验可反映颗粒粒径对荷叶膳食纤维相关特性的影响。

　　2.2 LIDF 的结构分析

　　2.2.1 显微结构观察

　　4 种不同颗粒粒径的 LIDF 显微结构，经酶解后 LIDF-A、LIDF-B 和 LIDF-C表面出现孔洞，与 Ma[4]通过蛋白酶提取孜然膳食纤维以及 Wang[16]通过淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶提取猕猴桃膳食纤维的显微结构表面出现孔洞情况相似，可能与原料中非纤维组分被酶解相关。因纤维是荷叶叶脉的主要组分，荷叶经淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解后的孔洞更易于出现在叶脉之间的表皮及叶肉部分，孔洞出现部位更具有规律性。LIDF-A 和 LIDF-B 中可观察到荷叶的叶脉纤维多被纵向剪切破碎，LIDF-C 和 LIDF-D中除纵向剪切破碎外还可观察到荷叶纤维被横向剪切破碎，荷叶内质网格状纤维结构明显暴露出来。不溶性膳食纤维主要通过包裹、吸附等物理方式在机体发挥功效，LIDF 颗粒粒径不同引起的比表面积差异，以及酶解后出现的 LIDF 表面孔洞和荷叶内质纤维的破碎程度都可能直接影响 LIDF 的理化功能特性。

　　2.2.2 红外光谱分析

　　植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，含有烷烃、酮类、酯类、芳香烃和醇类等多种官能团。通过红外光谱图中不同官能团的特征吸收峰位置和强度能推断基团种类和化学键类型，红外光谱分析已成为表征纤维素结构的常用方法[8]。可知 LIDF 具有纤维素的特征吸收峰，4 种不同颗粒粒径 LIDF 的红外光谱图吸收峰的峰形相似，未出现新的吸收峰，表明在本研究颗粒粒径的区间范围内并未有新的官能团出现，并未引起 LIDF 化学基团的变化。与 Huang[17]、Payling[18]的研究一致，食品加工主要影响多糖类组分的宏观结构和微观结构，而不会改变分子结构。其中 LIDF 在 3 348 cm-1左右出现较为延展圆滑的吸收峰，可能与其中的纤维素和半纤维素-OH 的伸缩振动有关，进一步可与 LIDF 具有一定的持水性相关[8]。在 2 921 cm-1 左右出现弱吸收峰，可能与糖类甲基和亚甲基上-CH 的伸缩振动相关，也反映了 LIDF 存在纤维素和半纤维素结构[19]。

　　在 1 616cm-1 左右出现较强吸收峰可能是 C=O 的特征峰，表明 LIDF 中含有较多的糖醛酸。在 1 417cm-1 左右出现弱吸收峰，可能为-CH 弯曲振动峰，可初步推测 LIDF 中的纤维素晶型为 I 型[20]。在 1 031 cm-1和 1 054 cm-1左右出现较强吸收峰，可能是 C-O-C 中 C-O 伸缩振动和 C-O-H的 O-H 变角振动。4 种不同颗粒粒径 LIDF 的红外光谱图吸收峰峰形相似、强度略有差异，推测可能 4 种 LIDF 中纤维素的结晶状态相同，结晶度有所变化。

　　2.2.3 X 衍射分析

　　从植物细胞壁中提取的不溶性膳食纤维多含有纤维素结晶体。4 种不同颗粒粒径的 LIDF 衍射角 2θ 在 15°、22.5°附近有结晶纤维素 I 的特征衍射峰，表明 LIDF 具有结晶纤维素 I 型结晶结构，其中包含有纤维素的结晶区域和由非结晶纤维素、半纤维素和木质素组成的无定形区[4, 19]，与红外光谱的分析结果相似。不同颗粒粒径 LIDF 的 X 衍射图中衍射峰的峰值位置和宽度基本不变，表明在研究的颗粒粒径区间范围内 LIDF 的纤维素晶型未发生变化，同为结晶纤维素 I 型。不同的是随着颗粒粒径的减小，各衍射峰的高度和强度有所变化，通过 Segal 的公式计算出 LIDF-A、LIDF-B、LIDF-C、LIDF-D 的结晶度指数分别为 22.25%、20.98%、19.40%、17.02%。

　　表明粉碎粒径降低了不溶性膳食纤维中纤维素的结晶度，这与 Ullah[21]对不同粒径的豆渣不溶性膳食纤维研究结果相似。可能因为在干法粉碎剪切作用下颗粒粒径越小，纤维结构更加松散，更多的结晶区暴露出来，晶区更易于发生破裂。Lin[22]的研究表明，纤维素的结晶度越高，其抗拉伸强度和硬度越高，其柔软度、吸湿和溶胀性等指标越低。故 4 种不同颗粒粒径的 LIDF 结晶度指数不同可能直接影响 LIDF的物理特性。

　　2.3 LIDF 的功能成分含量

　　4 种不同颗粒粒径的 LIDF 中不溶性膳食纤维含量在 69%~74%之间，表明荷叶粉在常规提取过程中非纤维成分酶解不完全，与 Ma[3]的研究结果相似。颗粒粒径较大两组(LIDF-A 与 LIDF-B)的不溶性膳食纤维含量显著高于颗粒粒径较小的两组(LIDF-C与 LIDF-D)(P<0.05)。结合颗粒粒径分布和显微结构观察，与 LIDF-C 和 LIDF-D 相比，LIDF-A 和 LIDF-B 破碎程度较低，可观察到的荷叶叶肉相对较多，在提取过程中更易于出现非纤维类组分酶解不充分导致不溶性膳食纤维的含量较低。黄酮、多酚类化合物具有较好的抗氧化性，可通过氢键、疏水相互作用、共价键或物理夹带等方式与膳食纤维联接从而到达肠道通过发挥抗氧化作用[23]。从表 3 可知随着 LIDF 颗粒粒径的减小其总黄酮、总多酚含量逐渐减小，颗粒粒径较大两组(LIDF-A 与 LIDF-B)的总黄酮、总多酚含量与颗粒粒径较小两组(LIDF-C 与 LIDF-D)含量差异更为明显。荷叶粉的颗粒粒径越小，提取过程中颗粒与提取液接触越充分，可溶性的黄酮、多酚类化合物越易于溶出。

　　2.4 LIDF 体外吸附特性

　　在研究的颗粒粒径范围内，LIDF 体外吸附特性随着颗粒粒径的减小先增高后降低。LIDF-B 的持油力、持水力相对较高，分别为 6.28、5.22 g/g。LIDF-C 的阳离子交换能力为 0.172 mmol/g，pH=2 条件下对胆固醇的吸附能力为 13.41 mg/g，pH=7 条件下对胆固醇的吸附能力为 49.74 mg/g，对胆酸钠的吸附能力为 90.95 mg/g，对葡萄糖的吸附能力为 6.80 mmol/g，与其他三组相比相对较高。有研究表明，膳食纤维体外吸附特性与颗粒的比表面积、纤维分子结构、粉体微观结构以及纤维结晶度等因素相关[4, 24, 25]。

　　结合粒径分布、扫描电镜、傅里叶红外光谱及 X 衍射光谱结果分析，当 LIDF 颗粒粒径减小时，比表面积增加，物理吸附能力增强;纤维结晶度降低，纤维结构从致密转变为相对松散，使得内部空隙增加，物理截留能力增强;同时纤维分子中的羟基、氨基、羧基等相关吸附基团暴露更多[24]，也利于增强对水分、阳离子等的吸附能力。而膳食纤维颗粒粒径过小，又可能导致膳食纤维的网络结构过度破碎使得吸附能力降低[13, 25]。结果表明，LIDF-B、LIDF-C 的体外吸附特性相对较佳，LIDF 颗粒粒径过大或过小都不利于 LIDF 的体外吸附特性。

　　2.5 LIDF 感官品质

　　2.5.1 色度

　　在研究的颗粒粒径范围内，随着颗粒粒径的减小 LIDF 粉体 L*值(亮度)先增加后降低，a*值(红色)和 b*值(黄色)增加，与 Jiang[26]、Ikram[27]研究结果相似。颗粒粒径减小利于粉体混合均匀度增加，L*值(亮度)增高[26];同时颗粒粒径减小导致比表面积增大，粉体易与反应物接触发生酶解或非酶反应产生深褐色产物使 L*值(亮度)降低[27]。在本研究中，LIDF-D 的 L*值(亮度)虽低于 LIDF-C，但两者无显著性差异。LIDF 粉体 a*值(红色)增加可能与粒径越小越易与反应物接触发生酶解或非酶反应产生深褐色产物使LIDF 偏红相关[27]。LIDF 粉体 b*值(黄色)增加可能与粒径减小有利于酚类化合物发生聚集有关[26]，在本研究中 LIDF-B 的 b*值(黄色)虽略高于 LIDF-C，但两者无显著性差异。

　　3 结论

　　荷叶富含多酚类物质和膳食纤维，符合天然优质膳食纤维的来源条件，具有较好的开发潜力。本试验通过对比分析 4 种不同颗粒粒径 LIDF 的结构、理化特性和食用感官品质，筛选出 LIDF 作为高纤维食品辅料开发的最佳粒径。荷叶经淀粉酶、蛋白酶和葡萄糖苷酶酶解制备 LIDF，显微结构表明 LIDF 表面出现孔洞，随着颗粒粒径减小，荷叶内质网格状纤维暴露程度增加。光谱分析表明 LIDF 具有纤维素 I 型结晶结构，颗粒粒径减小不引起 LIDF分子结构的变化，可降低纤维素结晶度指数。随着颗粒粒径减小，LIDF 总黄酮、总多酚含量降低，不溶性膳食纤维含量增加，颗粒粒径较大两组(LIDF-A 与 LIDF-B)与颗粒粒径较小的两组(LIDF-C 与 LIDF-D)含量差异更为明显。随着颗粒粒径减小，LIDF 的体外吸附特性升高后降低，LIDF-B、LIDF-C 的体外吸附特性相对较佳，LIDF 颗粒粒径过大或过小都不利于 LIDF 的体外吸附特性。LIDF 粉体 a*值(红色)、b*值(黄色)及其产品感官评分随颗粒粒径减小而增高。本试验结合考虑评价出 LIDF-C(D50 58.35 μm)作为高纤维功能食品辅料的开发潜力较好，为荷叶膳食纤维功能性的深入研究提供理论依据。

　　参考文献

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　　作者：郑 慧，孙 艳，张眙曼，李娅迪，肖 玥，蒋益繁，杨 勇