生物炭对杧果根系生长、土壤养分和微生物群落的影响

　　摘要: 【目的】研究添加生物炭对杧果根层土壤养分含量、根系生长和土壤微生物群落结构的影响，为杧果园科学施用生物炭提供理论参考。【方法】以台农一号杧果为研究对象，设置常规施肥 (CK)、常规施肥配施3% 生物炭 (BC) 和水肥一体化施肥配施 3% 生物炭 (FBC) 3 个处理，分析土壤养分和根系构型的变化，利用 Illumina 高通量测序技术比较土壤细菌和真菌群落的差异。【结果】与 CK 相比，BC 和 FBC 处理土壤 pH 和有机质含量升高，果期 BC 处理的土壤碱解氮和有效磷含量显著升高，花期 BC 和 FBC 处理的土壤速效钾含量显著升高;果期 BC 处理的根质量密度和根长密度显著增加，根平均直径差异不显著，根盒维数表现为BC>FBC>CK。BC 处理提高了土壤细菌物种数、丰度和多样性，降低了土壤真菌多样性;FBC 处理降低了细菌的丰度和多样性;BC 和 FBC 处理提高了变形菌门 (Proteobacteria)、厚壁菌门 (Firmicutes)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes) 和担子菌门 (Basidiomycota) 等微生物门水平上的丰度，绿弯菌门 (Chloroflexi) 和子囊菌门 (Ascomycota) 丰度降低;BC 处理的芽单胞菌属 (Gemmatimonas)、鞘脂单胞菌属 (Sphingomonas) 和水恒杆菌属 (Mizugakiibacter) 显著富集，FBC 处理的芽孢杆菌属 (Bacillus)、Acidibacter、链格孢属 (Alternaria) 和青霉属 (Penicillium) 显著富集。冗余分析结果表明：有机质、碱解氮和有效磷含量是土壤细菌和真菌群落结构变化的驱动因子，pH 是真菌群落结构变化的驱动因子，且根系生长发育受土壤环境因子调控。【结论】添加生物炭有利于提高杧果园土壤养分有效性，改善土壤微生物环境，促进根系生长。

　　关键词: 生物炭;土壤养分;根系;微生物;杧果

　　海南省是中国唯一全部位于热带地区的省份，拥有得天独厚的热区资源，是 “热带水果之王”杧果最适宜的产区之一。据统计，截至 2020年，海南省杧果种植面积达 5.8 万 hm2，产量达76 万 t，主要分布在三亚市、东方市、乐东县、陵水县和昌江县[1]。海南省杧果种植土壤类型多为砖红壤和燥红土，土层较厚，其中燥红土质地多为轻壤土[2]，保水保肥能力差，有机质含量低，养分含量变异大[3-4]。果实养分和果实品质受土壤养分的制约[3,5]，目前杧果园主要施肥方式为沟施和水肥一体化施肥，肥料的大量投入造成了潜在的环境风险[6]，提高土壤养分有效性和杧果根系对养分吸收的生物学潜力已成为研究重点。

　　生物炭是生物质在厌氧条件下热解制得的颗粒状有机物质，具有高 pH、高碳含量、疏松多孔、官能团丰富且吸附能力强等特点[7-8]。关于生物炭提高土壤肥力效应及微生物群落对生物炭响应机制的研究备受关注。大量研究表明：添加生物炭可以提高土壤中速效养分、有机质含量和酸性土壤 pH[9-12]。田孝志等[13]在紧实土壤中添加稻壳炭可增加苹果幼树根系密度和生物量，改善根系构型。

　　前人关于生物炭对土壤微生物群落的变化研究结果存在差异。何秀峰等[9]研究表明：施用 5% 的生物炭可以提高葡萄幼苗根际细菌丰度，对细菌多样性影响较小;高文慧等[14]研究认为：添加秸秆生物炭对大豆根际细菌多样性和丰度无影响，可提高真菌的丰度和多样性;YAO 等[11]对黑土连续施用 3 年生物炭改良发现：土壤细菌多样性和丰度增加，细菌群落结构改变，尤其可影响慢生根瘤菌属 (Bradyrhizobium)、芽孢杆菌属 (Bacillus) 和土微菌属 (Pedomicrobium) 等。生物炭具有优良的物理化学特性，前人研究多集中于生物炭对土壤理化性质和土壤微生物的作用，缺乏土壤理化性质、土壤微生物和根系生长三者间相互作用关系的研究。本研究结合海南省杧果实际生产情况，通过原位研究施肥沟添加生物炭对根层土壤养分、杧果树根系生长和微生物群落变化的影响及其关系，探寻生物炭对水肥一体化施肥和沟施的影响异同，以期为生物炭在杧果园的施用提供科学参考。

　　1 材料与方法

　　1.1 试验地概况

　　于 2019 年 6 月—2021 年 5 月在海南省乐东黎族自治区海南省热带作物标准化示范园 (乐东佛罗杧果标准化生产基地) 开展田间试验，果园位于 N18°24′、E108°39′，气候类型为热带季风气候，雨旱季分明，雨季集中在 4—8 月，年平均气温 24.5 ℃，年降水量约 1 500 mm，年日照时间约 2 000 h。供试植株为 20 年树龄的台农一号杧果树，果园土壤为海相沉积燥红土，土壤 pH 为5.59，有机质含量 15.59 g/kg，全氮含量 0.78 g/kg，碱解氮含量 26.39 mg/kg，全磷含量 1.02 g/kg，有效磷含量 68.00 mg/kg，全钾含量 19.12 g/kg，速效钾含量 66.85 mg/kg。供试生物炭为椰壳生物炭，由椰壳于 500 ℃ 条件下厌氧炭化 3 h 制得，pH为 10.06，有机碳含量 64.44%，全氮含量 0.10%，全磷含量 0.28%，全钾含量 1.09%。

　　1.2 试验设计试验共设置 3 个处理: 未添加生物炭的常规化肥沟施为对照组 (CK)、常规施肥配施生物炭(BC) 和水肥一体化滴灌施肥配施生物炭 (FBC)，每个处理设置 3 个重复，每个重复 6 株果树，试验小区采取随机区组排列。田间施肥量为 N108 kg/hm2， P2O5 30 kg/hm2， K2O 130 kg/hm2，于每年 6 月 (攻梢期)、10 月 (催花期) 和次年3 月 (壮果期) 3 个时期按照 3∶4∶3 比例施入。参考肖茜等[15]的研究，本试验 BC 和 FBC 处理的生物炭按照施肥沟土壤质量的 3% (4.5 t/hm2) 于攻梢期与化肥一同施入施肥沟，与土壤混匀掩埋。试验田其他田间管理措施保持一致。施肥沟为杧果树滴水线处规格为长 100 cm、宽 30 cm、深20 cm 的 2 条对称沟。

　　1.3 土壤样品的采集与测定

　　分 别 于 2020 年 12 月 5 日 (催 花 肥 后 1 个月) 和 2021 年 4 月 12 日 (壮果肥后 1 个月) 采用土钻采集施肥沟土壤，沟内采用 5 点取样法，1 个重复取 5 个样品，去除杂物后作为 1 个根层土壤混合样品，带回实验室经自然风干、磨细和过筛后进行土壤养分测定。土壤 pH 采用 pH 计测定;有机质含量采用重铬酸钾容量法测定;碱解氮含量采用碱解扩散法测定;有效磷含量采用NH4F-HCl 浸提—钼锑抗比色法测定;速效钾含量采用乙酸铵溶液浸提—火焰光度法测定。将采集的土壤用干冰保存送往北京奥维森基因科技有限公司进行样本 DNA 提取、PCR 扩增和 Illumina Miseq 测序。

　　使用德国 QIAGEN 公司的 DNeasy PowerSoil Kit 试剂盒提取样品基因组 DNA 后进行 1% 琼脂糖凝胶电泳检测。采用含有 Barcode 的特异引物对细菌 16S rRNA V3~V4 区 (引物为 5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG3′和 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 以及真菌ITS1 区(引物为5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3 ′和 5 ′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3 ′)进行扩增，PCR 产物使用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测扩增目的条带大小，并用 Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化，扩增完成后构建文库，检测合格后使用 Illumina MiSeq 平台上机测序。

　　1.4 根系样品的采集与测定

　　分别于 2020 年 12 月 5 日 (花期) 和 2021 年4 月 12 日 (果期) 采用根钻法钻取施肥沟内土壤和根系，根钻直径为 10 cm，深 20 cm，底部为锯齿状，可以切割土壤和根系;每个施肥沟钻取3 次，去除多余土壤后将根系带回实验室洗净，使用 EPSON EXPRESSION 10000XL 根系扫描仪扫描根系，输出的根系图片使用 WinRHIZO 软件分析得到根长和根平均直径等数据。扫描后的根系样品于 75 ℃ 烘箱烘干后称量，获得根系干质量。根质量密度为单位体积内的根系干质量，根长密度为单位体积内的总根长。

　　根系的分形维数可以直观地反映根系的发育程度和分支复杂程度，根系分支越复杂，发育程度越高，其分形维数越高。

　　1.5 数据分析

　　将土壤微生物测序下机数据使用 Trimmomatic 和 Pear 软件进行质控，使用 FLASH 软件拼接，使用 Vsearch 软件去除嵌合体和短序列从而获取有效序列，在 97% 的相似水平下用 uparse[17]法聚类生成 OTUs，利用 RDP Classifier 分别比对 Silva[18]和 Unite[19]数据库，并对细菌和真菌进行物种注释，置信度阈值设为 0.7。使用 SPSS20.0 进行单因素方差分析，用 Duncan’s 法进行显著性检验，使用 OriginPro 9.8 进行数据可视化作图，运用 LEfSe 分析比较具有显著组间差异的菌群及其进化关系，将各组中 LDA 值大于 3.8 且P<0.5 的差异物种 用 LDA 柱状图展示;使用Canoco 5 对土壤环境因子、根和微生物群落进行冗余分析。借助 MATLAB 9.5 将根系 RGB 图像转化为二值矩阵[20]，使用 FracLab 工具箱计算根系盒维数。

　　2 结果与分析

　　2.1 生物炭对根层土壤 pH 及速效养分的影响

　　与常规施肥 (CK) 相比，添加生物炭 (BC) 在花期和果期均可显著提高土壤 pH(P<0.05)，水肥一体化配施添加生物炭 (FBC) 对土壤 pH 的提高没有达到显著水平 (P>0.05);BC和 FBC 处理的土壤有机质含量在花期和果期较CK 均有显著提高;花期 BC 和 FBC 处理的土壤速效钾含量显著高于 CK (P<0.05)，但土壤碱解氮和有效磷含量与 CK 无显著差异 (P>0.05);果期 BC 处理的碱解氮和有效磷含量均显著高于CK (P<0.05)，BC 和 FBC 处理的土壤速效钾含量较 CK 分别提高 23.74% 和 28.21%，但差异未达到显著水平 (P>0.05)。说明添加生物炭可提高土壤 pH、有机质和速效钾含量，在果期还可提高土壤碱解氮和有效磷含量。

　　2.2 生物炭对杧果根系生长的影响

　　花期 3 个处理间的根质量密度和根长密度均无显著差异 (P>0.05);果期 BC 处理的根质量密度和根长密度显著大于 CK (P<0.05)，FBC 处理的根长密度显著大于 CK (P<0.05)。花期FBC 处理的根平均直径显著高于 BC 处理 (P<0.05)，而与 CK 处理无显著差异 (P>0.05)，果期3 个处理的根平均直径无显著差异 (P>0.05)。花期 3 个处理根系盒维数无显著差异 (P>0.05)，果期 BC 和 FBC 处理的根盒维数分别比 CK 提高8.44% 和 7.14%，且 BC 显著高于 CK (P<0.05)。可见，添加生物炭可通过增加杧果树根长、根质量和细根数量提高根系的分形维数，促进杧果树根系生长。

　　2.3 生物炭对根层土壤微生物群落多样性的影响

　　2.3.1 土壤微生物群落 Alpha 多样性

　　土壤细菌检测到的 OTU 总数为 4 480，3 个处理共有的 OTU 数为 1 514，BC处理特有的 OTU 数为 831，CK 和 FBC 处理分别只有 360 和 448 个特有 OTU;土壤真菌检测到的 OTU 总数为 2 385，3 个处理共有的 OTU 数为 313，CK、BC 和 FBC 特有的 OTU 分别为 514、475 和 493。说明添加生物炭可以增加土壤细菌物种数，但对真菌物种数没有明显影响，而水肥一体化加生物炭对土壤细菌和真菌数量没有明显影响。

　　每个处理细菌和真菌的样本文库覆盖率都超过 0.97，说明测序结果可以代表样本中微生物的真实情况。BC 处理细菌的 Chao 1 指数、观测物种数和 Shannon 指数均显著大于 CK(P<0.05)，FBC 处理则均显著小于 CK (P<0.05)，3个处理的谱系多样性指数无显著差异;3 个处理真菌的 Chao 1 指数、观测物种数和谱系多样性指数均无显著差异 (P>0.05)，BC 处理的真菌 Shannon 指数显著低于 CK (P<0.05)。说明添加生物炭可提高细菌群落的丰富度和多样性、降低土壤真菌的多样性，而水肥一体化施肥可降低细菌群落丰富度和多样性。

　　2.4 土壤环境因子、根系构型和微生物群落的关系

　　CK、BC 和 FBC 的细菌和真菌群落集中在不同区域，细菌和真菌群落组间差异显著 (P<0.05)，其中土壤有机质、碱解氮和有效磷含量对细菌和真菌的群落组成均有显著影响(P<0.05)，pH 对真菌群落组成有显著影响 (P=0.03)。根长密度、根质量密度和真菌群落具有显著的相关关系 (P<0.05)。图中根平均直径和碱解氮含量向量夹角最小，表示土壤碱解氮含量与根平均直径呈正相关，依此类推，根质量密度与土壤 pH 和有效磷含量呈正相关，根长密度与土壤有机质和速效钾含量呈正相关，根盒维数与土壤pH、有机质、有效磷和速效钾含量均有一定的相关性。

　　3 讨论

　　生物炭孔隙结构复杂、比表面积大，具有很强的吸附性能[21-22]和较高的阳离子交换量[23]，能吸附土壤中的 K+、Ca2+和 NH4+等盐基阳离子[24-25]，施入土壤后，土壤 pH 和有机质含量显著提高。水肥一体化配施生物炭对土壤 pH 的提高未达到显著水平，是由于滴灌施肥在水肥耦合效应下有助于肥料养分在土壤中充分释放，铵态氮肥在土壤中硝化和被植物吸收会释放 H+[26-27]，所以 FBC处理的土壤 pH 小于 BC 处理。施入生物炭短期内可显著提高土壤有机质含量是由于其本身碳含量高，而其长期影响机制和对实际生产的意义仍有待进一步深入研究。氮、磷和钾作为“植物生长三要素”，对植物生长发育有重要作用。本研究表明：添加生物炭可以提高土壤碱解氮、有效磷和速效钾含量，这与 LIU 等[28]的研究结果一致;而 FBC 处理的土壤碱解氮和有效磷含量较 BC 处理有不同程度的降低，其原因可能是水肥一体化施肥时，硝态氮和有效无机磷源 (Ca2-P、Ca8-P 和 A1-P) 比较容易向根层下方土壤淋溶[29]。

　　生物炭可以增加土壤阳离子交换量和对钾离子的固持能力，降低钾素淋失量[30]，故 BC 和 FBC 处理均可增加土壤速效钾含量。根系生长和土壤养分环境息息相关，生物炭改变了土壤环境，促进根系生长发育，间接影响根系对土壤养分的吸收能力[31]。本研究表明：BC 和 FBC 处理均可增加杧果树果期根质量密度、根长密度和根盒维数。SONG 等[32]研究发现：施用生物炭可使玉米根长密度显著提高，细根数量增长 2 倍，根长和可溶性有机碳、有效磷和土壤容重密切相关，与本研究结果基本一致。

　　根据冗余分析可知：影响杧果树根质量密度的主要因子是土壤 pH 和有效磷含量，影响根长密度的主要因子是有机质和速效钾含量。添加生物炭可提高土壤 pH 和有机质含量，从而提高土壤养分的有效性，有机质同时可以促进土壤结构的形成，改善土壤物理性质[33-34]，有利于根系的伸长生长。根系盒维数可以用来表示根系发育程度和分支复杂程度，与细根数量也呈正相关[35];本研究也表明根系盒维数与各土壤因子均表现出一定的正相关;刘秀[36]研究表明：细根生产力受土壤养分限制，与土壤氮、磷元素和有机质含量呈显著正相关。研究结果说明添加生物炭有利于杧果树根系伸长和细根生长。

　　随作物类型、土壤类型、施肥方式和生物炭种类等的不同，生物炭对微生物群落的影响也存在差异[9-12,14]。本研究中，添加生物炭可提高细菌丰富度和多样性，却降低了真菌多样性，这与YAO 等[11]在东北黑土上施加生物炭的研究结果一致。变形菌门、放线菌门和酸杆菌门为细菌中的优势门，BC 和 FBC 处理的变形门菌丰度增加，这与 YAO 等[11]和 XU 等[37]的研究结果一致。变形菌门趋向于养分丰富的环境，添加生物炭提高了土壤有效氮、磷、钾养分含量，有利于变形菌门富集。绿弯菌门属于能适应土壤恶劣环境的贫营养型微生物[38]，本研究发现绿弯菌门为 CK 处理显著富集的差异物种，BC 和 FBC 处理的土壤有机质和速效氮、磷、钾养分高，绿弯菌门丰度则显著降低，这可能是由于施入生物炭提高了土壤肥力，绿弯菌门在群落竞争中不占优势。

　　厚壁菌门和隶属于厚壁菌门的芽孢菌纲到属均属于FBC 处理富集的差异物种，芽孢杆菌能与变形菌纲、放线菌纲和浮酶状菌纲等稳定共存[39]，它们在土壤中均具有良好的反硝化作用，容易造成土壤氮素损失，这可能是果期 FBC 处理的碱解氮含量显著低于 BC 处理的原因。本研究表明：土壤真菌门水平以子囊菌门占绝对优势，3 个处理的相对丰度均在 75% 以上，施用生物炭后子囊菌门丰度降低，FBC 处理下降尤为明显。子囊菌多为腐生菌[40]，可以分解动植物残体，也会引起根腐、叶斑和茎腐等病症[41];担子菌门可以分解土壤中难以分解的有机质[42]，施入的生物炭自身含有难分解的生物质组织、纤维素和木质素等，提高了土壤难分解有机质含量，使土壤担子菌门增加，这与张燕林等[10]的研究结果一致。

　　4 结论

　　施用椰壳生物炭可以提高土壤 pH、有机质和速效钾含量，改善土壤微生物群落结构，从而促进杧果树根系伸长和细根生长。有机质、碱解氮和有效磷含量是土壤细菌和真菌群落结构变化的共同驱动因子，水肥一体化和添加生物炭有利于土壤微生物的优势菌门和具有促生作用的有益菌属富集。

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　　作者：范声浓1， 王烁衡1， 于良君2， 林一凡1， 王　瑞1， 吴　昊1， 林　电1 **