为探明水体不同含量氨氮对中华绒螯蟹幼蟹蜕壳、生化组成和抗氧化能力的影响，将体质量(6.13±0.05)g的中华绒螯蟹置于水温(22.0±0.5)℃、pH 7.63±0.44，氨氮质量浓度分别为0(对照组)、10.47、20.93、31.40、41.87 mg/L的养殖水中，在氨氮暴露0、3、6、9、12 d测定中华绒螯蟹的存活率、生长指标、生化组成和抗氧化酶活性。试验结果显示：在氨氮暴露期间，10.47 mg/L氨氮处理组中华绒螯蟹的存活率和蜕壳率几乎未受影响，而其他氨氮处理组中华绒螯蟹存活率与蜕壳率显著降低(P<0.05);蟹肉组织粗蛋白和粗脂肪等能量物质的消耗随着氨氮质量浓度的升高而减少;10.47 mg/L氨氮处理组肝胰腺组织超氧化物歧化酶活性在暴露初期显著提高，增强了抗氧化能力，且丙二醛含量在氨氮暴露后未受影响;随着氨氮质量浓度的升高，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性显著降低(P<0.05)，丙二醛含量显著增加(P<0.05)。试验结果表明，氨氮质量浓度高于20.93 mg/L能够明显抑制中华绒螯蟹生长发育，降低抗氧化酶活性，引发氧化应激。试验结果可为中华绒螯蟹对氨氮胁迫响应机制的研究及养殖水环境的改善提供基础数据。
关键词：氨氮;中华绒螯蟹;生长性能;生化组成;抗氧化
论文《 氨氮对中华绒螯蟹蜕壳和抗氧化能力的影响》发表在《水产科学》，版权归《水产科学》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的淡水养殖品种，味道鲜美、营养丰富，深受人们喜爱[1]。作为我国中华绒螯蟹主产区之一，辽河流域广泛发展“稻蟹共生”种养模式。在该种养模式下，中华绒螯蟹幼蟹投入田间养殖恰逢施肥关键时期，不适当的氮肥用量可能导致水体氨氮浓度增高[2-3]。氨氮主要以离子氨和非离子氨的形式存在于养殖水体中，非离子氨毒性较离子氨更强，这是因为非离子氨能够扩散穿透细胞膜[4]。氨氮胁迫是水产养殖中常见的环境胁迫之一，诱导水产动物的应激反应，影响其生长发育，造成水产养殖的经济损失[5]。
近些年，氨氮对水产动物生长及生理的影响已引起业界广泛关注。水体中过量的氨氮会抑制水产动物的生长性能，引发代谢功能紊乱，破坏抗氧化及免疫防御系统，甚至引发炎症反应[6-8]。已有研究表明，在氨氮胁迫后，凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的存活率降低，随着氨氮胁迫时间的延长，凡纳滨对虾中合成谷氨酰胺和尿素的关键酶活性及其生化物质发生改变[9]。Chen等[10]进行了60 d慢性氨氮胁迫试验后也发现，凡纳滨对虾的生长速率随着氨氮质量浓度的升高而降低，肝胰腺组织受损。刘洋等[11]发现，泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)在氨氮质量浓度为250 mg/L的慢性胁迫下，超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性随着胁迫时间的增加呈下降趋势，其抗氧化系统被破坏。余瑞兰等[12]通过120 h氨氮胁迫试验发现，非离子氨的毒性迫使鲫(Carassius auratus)血清组织中的碱性磷酸酶活性不断降低，进而破坏其非特异性免疫防御系统。洪美玲等[13-14]通过对体质量约70 g的中华绒螯蟹分别进行15 d和20 d的氨氮胁迫试验发现，随着氨氮质量浓度的增加和胁迫时间的延长，机体清除自由基的能力下降，非特异性免疫防御系统遭到损伤;同时，也有研究者对中华绒螯蟹幼蟹进行24 h急性氨氮暴露试验，以揭示氨氮胁迫对其肝胰腺组织能量代谢和抗氧化能力的影响[15]。笔者以中华绒螯蟹幼蟹为试验对象进行为期12 d的氨氮暴露试验，探究水体不同质量浓度氨氮暴露下中华绒螯蟹幼蟹蜕壳、生化组成及抗氧化酶活性的变化规律，明确长期氨氮胁迫下中华绒螯蟹幼蟹的蜕壳情况和适应机制，以期为中华绒螯蟹的健康养殖提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
中华绒螯蟹[(6.13±0.05)g]采自辽宁省盘锦市盘山县，运至实验室后，转移至65cm×42.5cm×35cm水箱中暂养7 d，使其适应水环境。随后，选取750只蟹体正常、健康活泼、附肢完整、规格均匀的中华绒螯蟹开展氨氮暴露试验。
基于“稻蟹共生”种养水体实际氨氮质量浓度和氨氮对中华绒螯蟹的急性半致死质量浓度(96h-LC50)[16]，以氯化铵作为氨氮来源，设置氨氮质量浓度分别为10.47、20.93、31.40、41.87 mg/L的氨氮处理组和无氮源添加的对照组，共5组，每组设3个平行，每个平行50只，置于2个直径45cm塑料盆中养殖，每盆25只。
在暂养和氨氮暴露试验期间，水温(22.0±0.5)℃，pH 7.63±0.44，充分曝气。参考文献[17]计算各氨氮处理组对应的NH₃质量浓度，分别为0.20、0.40、0.59、0.79 mg/L。每日8:00和18:00按照中华绒螯蟹体质量的2%投喂基础饲料，并观察饲料剩余情况，根据实际情况适当增减饲料投喂量。每次饲喂前1 h更换全部养殖水，调整相应的氨氮质量浓度，并清理排泄物和饲料残渣。氨氮暴露试验饲养周期为12 d，分别在第0、3、6、9、12天随机选取8只中华绒螯蟹进行指标测定。
1.2 样品采集
每日记录中华绒螯蟹的死亡情况和蜕壳情况。为了解各处理组中华绒螯蟹的生长情况，将取样的中华绒螯蟹用滤纸擦干表面水分后用电子天平称取体质量(精确至0.01g)。随后，冰浴麻醉5 min后，用经高温灭菌的剪子和镊子取出肝胰腺组织及包括体肉、足肉和钳肉在内的全部肌肉组织。其中，将肝胰腺组织表面水分用滤纸吸取后称量质量(精确至0.01g)。最后，将肝胰腺组织和肌肉组织装入离心管后放入液氮中速冻，放入-80℃冰箱中备用。
1.3 指标测定
1.3.1 生长性能指标测定
存活率(Rₛ)、蜕壳率(Rₘ)、质量增加率(w_WGR)和肝胰腺指数(w_HSI)的计算公式如下[18]：
- 存活率(Rₛ)=(试验结束时蟹数量/试验初始时蟹数量)×100%
- 蜕壳率(Rₘ)=(试验结束时蜕壳蟹数量/试验初始时蟹数量)×100%
- 质量增加率(w_WGR)=(试验结束时平均体质量-试验初始时平均体质量)/试验初始时平均体质量×100%
- 肝胰腺指数(w_HSI)=(肝胰腺质量/蟹体质量)×100%
式中，n₀和nₜ分别为试验初始和结束时各组中华绒螯蟹的数量，n为试验结束时各组中华绒螯蟹蜕壳数量;m₀和mₜ分别为试验初始和结束时各组中华绒螯蟹的平均体质量(g);mₕ和m分别为肝胰腺质量(g)和中华绒螯蟹体质量(g)。
1.3.2 生化组成指标测定
蟹肉组织的水分含量采用105℃烘干法测定(GB5009.3-2016)[19];粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定(GB5009.5-2016)[20];粗脂肪含量采用索氏提取法测定(GB5009.6-2016)[21]。
1.3.3 抗氧化相关指标测定
抗氧化相关酶指标测定所需的肝胰腺匀浆液参考文献[22]的方法制备。超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，试验操作方法和计算均按说明书进行。
过氧化氢酶活性参照文献[23]的方法测定，并稍作改动：取200 mL磷酸盐缓冲液加入0.3092 mL 30%过氧化氢溶液，充分混合，将3 mL该混合液与0.2 mL 1%中华绒螯蟹肝胰腺组织液混合，并迅速在240 nm处测定吸光度，每30 s测定1次，变化稳定记录数据(记录3 min内的吸光度)，将每分钟使吸光度变化0.01所需要的酶量定义为1个酶活性单位(U)。
过氧化物酶活性参考文献[24]的方法测定，并稍作改动：将2.2 mL 1%邻甲氧基苯酚和0.2 mL 1.5%过氧化氢与0.5 mL 1%肝胰腺组织液混合，并迅速在470 nm处测定吸光度，每30 s测定1次，变化稳定记录数据(记录3 min内的吸光度)，将每分钟使吸光度产生变化0.01所需要的酶量定义为1个酶活性单位(U)。
1.4 数据分析
质量增加率和肝胰腺指数测定试验重复5次，生化组成和抗氧化相关指标测定试验重复3次。所有试验数据均用平均值±标准差表示。应用SPSS19软件对数据进行单因素方差分析和LSD多重比较，设置P<0.05为差异显著。使用Origin 2018软件绘制图表。
2 结果与分析
2.1 氨氮暴露对中华绒螯蟹生长性能的影响
氨氮暴露对中华绒螯蟹存活率、蜕壳率和肝胰腺指数的影响见图1。在氨氮暴露期间，中华绒螯蟹的存活率呈现随氨氮质量浓度提升而降低的趋势，41.87 mg/L处理组中华绒螯蟹存活率为99.33%~83.33%，始终显著低于对照组(P<0.05)。然而，10.47 mg/L处理组存活率在氨氮暴露12 d后才与对照组产生显著性差异(P<0.05)，较对照组降低了2.66个百分点。
氨氮暴露第3 d，对照组和10.47 mg/L处理组中华绒螯蟹开始出现蜕壳现象，蜕壳率分别为1.33%和0.67%。20.93、31.40、41.87 mg/L处理组中华绒螯蟹在氨氮暴露第6 d开始出现蜕壳现象，蜕壳率分别为2.67%、2.67%和0.67%。
暴露12 d后，中华绒螯蟹的质量增加率与蜕壳率变化趋势相似，随氨氮质量浓度提升而降低(图2);与对照组相比，10.47、20.93、31.40、41.87 mg/L处理组中华绒螯蟹的蜕壳率分别显著降低了4.66个百分点、9.33个百分点、11.33个百分点、14.66个百分点(P<0.05)，质量增加率分别显著降低(P<0.05);41.87 mg/L处理组中华绒螯蟹蜕壳率和质量增加率最低，分别为12.67%和2.64%。
与对照组相比，10.47 mg/L和20.93 mg/L处理组肝胰腺指数在氨氮暴露期间几乎无显著性变化(P>0.05)，而31.40 mg/L和41.87 mg/L处理组显著降低(P<0.05)，暴露12 d后，分别降低了0.82、0.85个百分点。
图1 氨氮暴露对中华绒螯蟹存活率、蜕壳率和肝胰腺指数的影响 Fig.1 Effects of ammonia exposure on survival rate, molting rate, and hepatopancreas index of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis
注：不同字母表示差异显著(P<0.05)，下同。
图2 氨氮暴露对中华绒螯蟹质量增加率的影响 Fig.2 Effects of ammonia exposure on weight gain rate of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis
2.2 氨氮暴露对中华绒螯蟹生化组成的影响
氨氮暴露期间中华绒螯蟹肌肉组织粗脂肪、粗蛋白和水分含量的变化情况见图3。在氨氮暴露期间，10.47 mg/L处理组蟹肉组织的粗脂肪含量与对照组无显著性差异(P>0.05)，20.93、31.40、41.87 mg/L处理组粗脂肪含量显著低于对照组(P<0.05)，且随着氨氮质量浓度升高粗脂肪含量逐渐减少。
氨氮暴露第3 d，各处理组粗蛋白含量均达到最大值，其中41.87 mg/L处理组粗蛋白含量显著高于其他组(P<0.05)。氨氮暴露6 d后，与对照组相比各处理组粗蛋白含量显著减少(P<0.05)。氨氮暴露后蟹肉组织的粗蛋白含量和水分含量均随着氨氮质量浓度的升高而呈梯度减少(P<0.05)。
图3 氨氮暴露对中华绒螯蟹肌肉组织粗脂肪、粗蛋白和水分含量的影响 Fig.3 Effects of ammonia exposure on fat, protein contents and moisture in muscle tissue of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis
2.3 氨氮暴露对中华绒螯蟹抗氧化酶的影响
氨氮暴露对中华绒螯蟹肝胰腺组织抗氧化能力的影响见图4。氨氮暴露第6 d，对照组肝胰腺组织超氧化物歧化酶活性显著增加。与对照组相比，在氨氮暴露期间，10.47 mg/L和20.93 mg/L处理组超氧化物歧化酶活性先显著高于对照组(P<0.05)，随后逐渐降低至对照组水平，而31.40 mg/L和41.87 mg/L处理组超氧化物歧化酶活性始终显著低于对照组(P<0.05)。
10.47 mg/L处理组肝胰腺组织的丙二醛含量变化趋势与其超氧化物歧化酶活性变化趋势相似，其余处理组的丙二醛含量均显著高于对照组(P<0.05)。各处理组过氧化物酶和过氧化氢酶活性均显著低于对照组(P<0.05)，且氨氮质量浓度越高，过氧化物酶和过氧化氢酶活性越低。
图4 氨氮暴露对中华绒螯蟹肝胰腺组织抗氧化能力的影响 Fig.4 Effects of ammonia exposure on antioxidant capacity in hepatopancreas tissue of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis
3 讨论
3.1 氨氮暴露对中华绒螯蟹存活和生长的影响
存活率是反映水产动物生长性能最直接的指标之一，水产动物的死亡现象直接影响养殖的经济效益[25]。试验发现，41.87 mg/L处理组中华绒螯蟹在氨氮暴露第3天起存活率显著低于对照组(P<0.05)，这说明中华绒螯蟹在短时间内遭受高质量浓度氨氮胁迫会造成明显的死亡现象，且氨氮质量浓度越高，死亡现象越严重。10.47 mg/L处理组中华绒螯蟹在氨氮暴露12 d后存活率才显著低于对照组，这表明虽然短期内的低质量浓度氨氮暴露不影响存活率，但长期低氨氮胁迫也会造成中华绒螯蟹的死亡。
蜕壳是中华绒螯蟹生长的重要行为，中华绒螯蟹需要经历约18次蜕壳才能成长为成蟹[26]。20.93、31.40、41.87 mg/L处理组中华绒螯蟹首次出现蜕壳现象比对照组和10.47 mg/L处理组慢了3 d，这可能是由于高氨氮胁迫造成了蜕壳周期的推迟。一般情况下，蜕壳伴随着体质量的增加，生物出现明显的增长现象[27]。本试验中，中华绒螯蟹体质量增加情况进一步验证了氨氮胁迫对中华绒螯蟹蜕壳率的影响。在氨氮暴露结束后，各处理组的蜕壳率和质量增加率显著降低，且氨氮质量浓度越高生长受抑制程度越大。因此，长期氨氮胁迫对中华绒螯蟹的生长有一定的负面影响。Koo等[28]研究也表明，持续的氨氮暴露会降低虎头蟹(Orithyia sinica)的生长速度，甚至增加其死亡率。
肝胰腺组织是中华绒螯蟹消化、免疫和代谢的重要场所[29]。在氨氮暴露后期，对照组肝胰腺指数随着处理时间的延长而呈现明显下降的趋势，在此期间蜕壳的中华绒螯蟹也明显增多。研究表明，在蜕壳前中华绒螯蟹摄食减少，主要由肝胰腺组织和肌肉组织供能以保证蜕壳和幼体内部重构等生理活动的完成[30]。因此，肝胰腺指数的下降可能是蜕壳期间肝胰腺组织能源消耗导致的。10.47 mg/L和20.93 mg/L处理组的肝胰腺指数与对照组无显著差异，而31.40 mg/L和41.87 mg/L处理组在短时间内就会对肝胰腺指数造成影响，使之低于对照组。已有研究表明，中华绒螯蟹会加快消耗肝胰腺组织中的能量物质以抵抗高氨氮胁迫，这可能是肝胰腺指数降低的原因[31]，而肝胰腺组织中能量物质的变化规律则需进一步探究。
3.2 氨氮暴露对中华绒螯蟹生化组成的影响
肌肉是个体运动的直接组织，其储存的脂肪和蛋白质为中华绒螯蟹的生长代谢和日常活动提供能量[32]。本试验中，中华绒螯蟹在面对氨氮胁迫时，迅速动员脂肪和蛋白参与能量代谢以积极响应氨氮应激。在氨氮暴露短期内，20.93、31.40、41.87 mg/L处理组蟹肉的粗脂肪含量显著减少，各处理组粗蛋白含量增加至最大值，且氨氮质量浓度越大粗蛋白含量越高。粗蛋白含量增加可能是由在添加氨氮的水环境下养殖使氮元素在中华绒螯蟹体内积累导致的，Randall等[33]在关于鱼的氨氮毒性综述中也提出，环境中氨氮水平升高会损害鱼体内氨氮排泄或导致从环境中净吸收氨氮的含量提升。
随着氨氮暴露时间的延长，各氨氮处理组粗蛋白含量也显著减少。Richard等[34]对金头鲷(Sparus aurata)进行热应激研究时也发现相似现象。在氨氮暴露末期，氨氮质量浓度越高，粗蛋白的消耗越大。在氨氮暴露结束后，41.87 mg/L处理组粗蛋白含量最低。这些结果均表明水体氨氮质量浓度越高，中华绒螯蟹的应激损伤越严重。
3.3 氨氮暴露对中华绒螯蟹抗氧化能力的影响
中华绒螯蟹在生长过程中会产生活性氧，当体内的活性氧含量过高时会对机体产生负面影响[35]。肝胰腺是中华绒螯蟹激活抗氧化酶消除过量活性氧的关键场所[36]。超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶共同作用可以清除超氧阴离子自由基。具体来讲，超氧化物歧化酶可以将超氧阴离子分解成过氧化氢和氧气，过氧化物酶和过氧化氢酶进一步将过氧化氢分解成水和氧气，以保护机体免受过氧化氢的侵害[37-38]。
本试验中，对照组超氧化物歧化酶活性在氨氮暴露第6 d显著增加，笔者推测这可能是因为取样时恰好选取了蜕壳后软壳硬化的中华绒螯蟹。关于侧身地蟹(Gecarcinus lateralis)Y-器官在蜕壳周期过程中蛋白质组学的分析也有类似结果，在蜕壳期间，氧化应激相关差异蛋白超氧化物歧化酶显著上调[39]。10.47 mg/L处理组超氧化物歧化酶活性在氨氮暴露第3天显著增加，可能是中华绒螯蟹积极消除由氨氮暴露产生的过量活性氧的抗氧化机制，这与索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)响应镉胁迫的结果一致[40]。随着氨氮暴露时间的延长，10.47 mg/L处理组超氧化物歧化酶活性逐渐恢复到对照组水平。同时，10.47 mg/L处理组丙二醛含量变化趋势与其超氧化物歧化酶活性变化趋势一致，这些结果说明中华绒螯蟹可能逐渐适应了低氨氮养殖水环境。
在20.93 mg/L氨氮暴露期间，超氧化物歧化酶活性变化趋势与10.47 mg/L处理组相似，但恢复到对照组水平慢了3 d，过氧化氢酶和过氧化物酶活性显著减少，而丙二醛含量显著增加。这些结果说明当氨氮质量浓度提高时，机体抗氧化酶能力不足，超氧化物歧化酶活性增加而过氧化氢酶和过氧化物酶活性减少导致过氧化氢累积，细胞脂质氧化会产生丙二醛，含量越高对机体的损害越严重[41]。
当氨氮暴露质量浓度提升到31.40 mg/L和41.87 mg/L时，超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性均显著减少，且两组之间无显著性差异，31.40 mg/L和41.87 mg/L处理组丙二醛含量也显著增加。这些结果说明高氨氮胁迫会导致过量活性氧产生，抗氧化酶消耗过度，造成丙二醛累积，诱导氧化应激损伤。
在实验室环境下探究氨氮胁迫对中华绒螯蟹生长生理的影响存在一定的局限性。在实际生产中，“稻蟹共生”种养环境复杂，独特的土壤性质、不同的施肥方式和施肥用量都可能导致水体pH的提升，夏季也可能引发该种养模式下的高温胁迫。此外，除了通过水产动物自身生理代谢将氨氮转化为尿素和谷氨酰胺等毒性较低的物质外，在饲料中添加功能性饲料添加剂是增强其抵御环境胁迫能力的重要途径。孙元琛等[42]研究表明，饲料中添加纳米氧化铈能提升氨氮胁迫下中华绒螯蟹的存活率，增强其超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性。笔者将开展田间试验明确该种养模式下可能存在的多个胁迫因子联合作用对中华绒螯蟹生长代谢的影响机制，进一步以此为依据研发功能性饲料添加剂，以期为改善种养环境和中华绒螯蟹抗胁迫能力提供理论基础。
4 结论
对比不同质量浓度氨氮对中华绒螯蟹幼蟹存活、生长性能、生化组成、抗氧化能力的影响发现，中华绒螯蟹幼蟹可能会动员脂肪和蛋白质参与能量代谢以抵抗氨氮胁迫。当氨氮暴露质量浓度低于10.47 mg/L时，幼蟹存活和蜕壳几乎不会受到影响，抗氧化酶积极响应以调节抗氧化系统正常功能;当氨氮暴露质量浓度高于20.93 mg/L时，幼蟹生长发育延缓，肝胰腺组织产生严重氧化应激损伤;随着氨氮暴露质量浓度的提升，幼蟹的氨氮应激反应越严重，甚至会引起幼蟹的大量死亡。
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