目的：评价采用超临界二氧化碳脱细胞后动物源性骨修复材料的免疫原性和成骨能力。方法：将猪股骨前处理后随机分成两组，分别使用常规方法(常规对照组)和超临界二氧化碳(实验组)进行脱细胞处理，并以同种脱钙骨基质作为阳性对照。通过酶联免疫吸附试验和荧光染色法检测半乳糖-α-1,3-半乳糖(α-Gal)抗原清除率和DNA残留量。9只6周龄SPF级雄性裸鼠随机分成实验组、常规对照组和阳性对照组，在裸鼠股二头肌肌间隙中植入不同骨组织，术后4周取材，分别用苏木精-伊红(HE)染色和免疫组织化学检测植入部位诱导成骨能力及成骨相关蛋白表达。结果：实验组和常规对照组α-Gal抗原清除率分别为(99.09±0.26)%和(30.18±2.02)%，差异有统计学意义((t=58.67)，(P<0.01))。实验组、常规对照组和阳性对照组的DNA残留量分别为(13.49±0.07)、(15.20±0.21)和(14.70±0.17)ng/mg，其中实验组DNA残留量低于常规对照组((t=-13.41)，(P<0.01))和阳性对照组((t=-11.30)，(P<0.01))。HE染色结果显示，实验组术后4周植骨部位有多个骨生发中心伴成骨活跃、骨髓丰富;常规对照组和阳性对照组仅有少量骨生发中心，无明显的成骨细胞。免疫组织化学结果提示，实验组成骨相关蛋白碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原蛋白和骨钙蛋白的表达量较常规对照组和阳性对照组均有增加的趋势。结论：经超临界二氧化碳脱细胞处理的骨组织比临床上常用的同种脱钙骨基质和常规方法处理的骨修复材料具有更低的免疫原性和更好的诱导成骨能力。
关键词：骨修复;异种移植;脱细胞支架;超临界二氧化碳萃取;小鼠
论文《超临界二氧化碳萃取用于异种脱细胞骨修复材料的制备》发表在《浙江大学学报(医学版)》，版权归《浙江大学学报(医学版)》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
一、引言
临床上，各种大型骨创伤、骨肿瘤术后，超过临界值的骨缺损需要植入移植物辅助缺损修复。目前自体骨移植是修复骨缺损的金标准，但自体填充材料的塑形性差、填充度差、供体材料少，且两步手术带来的额外创伤使患者面临更大的并发症风险。理想的骨替代移植物应同时具备良好的骨传导性、骨诱导性和骨整合能力，具有良好的生物相容性，异种骨作为替代材料应运而生。
异种骨在结构、功能和生化成分上与原始骨组织相似，其具有的基质结构和成分在骨形成细胞的增殖、分化和保留中起重要作用，并且可以为血管和组织的形成提供空间，从而促进再生修复。然而，异种骨中的外源性细胞成分可能会使人体产生免疫排斥，使得外来骨基质无法融入正常的组织结构。因而，寻求安全可行的技术对异种骨进行脱细胞处理，消除其免疫原性物质至关重要。
脱细胞是一个复杂的过程，由于骨组织具有致密的坚硬结构，常规脱细胞试剂无法有效进入组织内部去除细胞等免疫原性组分，从而需要较长的脱细胞时间(15~30 d)，而长时间试剂接触可导致有毒的脱细胞试剂无法彻底清洗干净。另外，在目前的研究中异种骨需要通过各种生物化学试剂和物理等工艺技术来达到脱细胞的目的，而酸、碱和酶等生物化学试剂会导致细胞外基质结构的破坏。因此，需要更温和的脱细胞方案来更好地保存其生物化学和机械性能。
超临界二氧化碳是利用超临界流体二氧化碳作为萃取溶剂，将动物组织去除脂肪、细胞和非胶原蛋白的一种技术。二氧化碳能在相对较低的温度和压力条件下达到其临界点，并具有较高的传输速率和渗透率，而当恢复到常温常压时，二氧化碳会完全气化消失，不残留任何有害物质。二氧化碳的这些特性可以取代或减少生物材料在化学溶液中的暴露，在去除免疫原性物质的同时保留脱细胞材料的生物学特征和生物相容性。本研究聚焦异种骨脱细胞工艺，比较了常规脱细胞与超临界二氧化碳脱细胞骨修复材料在免疫原性去除和成骨能力方面的优劣，探索更好的脱细胞方案以获得临床上生物安全性和有效性更佳的天然骨修复材料。
二、材料与方法
(一)动物、材料和仪器
1. 实验动物：6周龄SPF级雄性裸鼠由浙江中医药大学提供。动物饲养于SPF级动物室，按照标准自由摄食、饮水，定期更换垫料;温度20~26℃，相对湿度40%~70%，24 h独立送风系统，12 h昼夜节律循环环境，适应性饲养7 d。
2. 实验材料：3~6月龄三元猪股骨购自浙江青莲食品股份有限公司;同种脱钙骨基质为北京鑫康辰医学科技发展有限公司产品;无水乙醇为湖州双林化学科技有限公司产品;高纯二氧化碳为杭州海杭气体设备有限公司产品;Triton X-100为美国VWR公司产品;盐酸为南京化学试剂股份有限公司产品;α-Gal抗原参考品和α-Gal抗原定量检测试剂盒均为北京三药科技有限公司产品;组织基因组DNA提取试剂盒为北京简石生物技术有限公司产品;DNA含量检测试剂盒为美国Thermo Fisher Scientific公司产品;NAT10多克隆抗体(ALP)、COL-1单克隆抗体、OCN多克隆抗体均为美国ProteinTech Group公司产品;RUNX2抗体为澳大利亚Affinity Biosciences公司产品;超敏兔鼠通用二抗为杭州浩克生物技术有限公司产品;二甲苯、盐酸分化液、石蜡、中性树胶为国药集团化学试剂有限公司产品;PBS、20×EDTA抗原修复液(pH 8.0)、BSA均为武汉赛维尔生物科技有限公司产品;免疫组织化学试剂盒为图凌杭州生物医药有限公司产品;4%多聚甲醛、苏木素染液、伊红染液为上海碧云天生物技术有限公司产品;氨水返蓝液为上海麦克林生化科技股份有限公司产品。
3. 实验仪器：超临界二氧化碳萃取仪为北京适安佳生物科技有限公司产品;超声清洗机为杭州宝珀超声波科技有限公司产品;冷冻干燥机为宁波双嘉仪器有限公司产品;恒温振荡器为上海科辰实验设备有限公司产品;电子天平为梅特勒托利多公司产品;冷冻研磨仪为上海净信实业发展有限公司产品;高速冷冻离心机、多功能酶标仪为美国Thermo Fisher Scientific公司产品;涡旋仪为浙江群安科学仪器有限公司产品;显微镜为日本尼康公司产品;免疫组织化学笔为美国Genetech公司产品;脱色摇床为上海琪特分析仪器有限公司产品;脱水机、生物组织自动包埋机、石蜡包埋机(冷台)为湖北贝诺医疗科技有限公司产品;转轮式切片机为徕卡显微系统上海有限公司产品;KD-P组织摊片机为浙江金华科迪仪器设备有限公司产品;烤箱为天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司产品;电热鼓风干燥箱为上海跃进医疗器械有限公司产品;数字化全切片病理扫描仪为宁波江丰生物信息技术有限公司产品。
(二)材料制备
猪股骨大小为20~25 cm，剔净骨组织表面骨肉，纯化水清洗去除骨组织残留的血液，将猪股骨加工成片状，随机分为两组，分别进行常规脱细胞处理(常规对照组)和超临界二氧化碳脱细胞处理(实验组)。常规对照组材料经体积分数为1%的Triton X-100脱细胞处理12 h，处理过程在100转/min频率的恒温振荡器中进行，每三小时更换Triton X-100一次，处理结束后用0.6 mol/L盐酸脱钙、纯化水超声清洗，清洗后冷冻干燥;实验组使用乙醇作为夹带剂，设定乙醇∶二氧化碳的流速比为1∶20，温度37℃，压力20 MPa，时间2 h，处理结束后用0.6 mol/L盐酸脱钙、纯化水超声清洗，清洗后冷冻干燥。
(三)ELISA法测定α-Gal抗原清除率
取常规对照组、实验组及猪股骨原材料，低温冷冻研磨(-50℃，70 Hz，1 min)成粉。取研磨后粉末各10 mg分别放入2 mL碾磨EP管中，分别加入1 mL含体积分数为1%的苯甲基磺酰氟裂解液，4℃低温匀浆5 min，室温放置3 h，10 000×g离心10 min，4℃过夜。之后，4℃、10 000×g离心30 min取上清液，用α-Gal抗原定量检测试剂盒检测残留α-Gal抗原含量，计算α-Gal抗原清除率：α-Gal抗原清除率=(1-a/b)×100%，其中a是经脱细胞处理后材料的残留α-Gal抗原含量，b是猪股骨原材料的α-Gal抗原含量。
(四)荧光染色法测试DNA残留量
取实验组、常规对照组及阳性对照组(同种脱钙骨基质)材料，低温冷冻研磨(-50℃，70 Hz，1 min)成粉。取研磨后粉末20 mg分别放入2 mL EP管中，加入0.4 mL脱钙液(0.125 g/mL EDTA二钠溶液)和0.04 mL 20 mg/mL蛋白酶K，55℃脱钙、消化3 h，1000×g离心4 min取上清液，用DNA纯化试剂盒进行DNA纯化，之后用DNA含量检测试剂盒测定DNA残留量。
(五)动物造模及分组
9只6周龄SPF级雄性裸鼠随机分成三组：实验组(植入骨组织用超临界二氧化碳脱细胞处理)、常规对照组(植入骨经常规脱细胞处理)和阳性对照组(植入同种脱钙骨基质)。手术前使用替拉唑(舒泰®50)行腹腔麻醉，腿部常规消毒铺巾，在无菌条件下于左侧大腿中部切开皮肤，切口长约1 cm，采用钝性剥离方法，沿着肌肉纤维方向平行制造一个袋状空隙，在股二头肌肌间隙中植入不同骨组织，植入后用缝线将肌肉与皮肤缝合。
(六)HE染色评价组织诱导成骨能力
试验样品植入模型4周后取材，经4%多聚甲醛固定后进行脱钙、脱水、包埋，制备6 μm的组织切片。将切片脱蜡复水，进行HE染色后封片，显微镜下观察诱导成骨情况。
(七)免疫组织化学检测成骨蛋白表达
按照上述方法制备组织切片，常规脱蜡至水，加入EDTA抗原修复缓冲液(pH 8.0)进行抗原修复，3%过氧化氢溶液室温下孵育25 min阻断内源性过氧化物酶，使用免疫组织化学笔沿组织外围轮廓画一个与组织间隔3~4 mm的小圈，圈内滴加3% BSA封闭，加入一抗4℃孵育过夜，滴加二抗室温孵育50 min，DAB显色，苏木素复染细胞核，脱水后中性树胶封片，镜检并采集图像，使用Image-Pro Plus 6.0软件选取阳性表达全部区域，统计阳性区域面积及累积光密度值，计算平均光密度值：平均光密度值=累积光密度值/面积。
(八)统计学方法
采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(xˉ±s)表示，组间比较采用t检验，(P<0.05)为差异具有统计学意义。
三、结果
(一)两组脱细胞骨组织α-Gal抗原清除率比较
实验组残留α-Gal抗原含量为(0.14±0.04)×10¹³个/mg，清除率高达(99.09±0.26)%;常规对照组残留α-Gal抗原含量为(10.76±0.31)×10¹³个/mg，清除率为(30.18±2.02)%。两组α-Gal抗原清除率差异具有统计学意义((t=58.67)，(P<0.01))。鉴于α-Gal为细胞膜标志物，结果提示超临界二氧化碳处理能更好地去除骨组织中的细胞膜。
(二)三组脱细胞骨组织DNA残留量比较
实验组DNA残留量为(13.49±0.07)ng/mg，常规对照组DNA残留量为(15.20±0.21)ng/mg，阳性对照组DNA残留量为(14.70±0.17)ng/mg。实验组DNA残留量显著低于常规对照组((t=-13.41)，(P<0.01))和阳性对照组((t=-11.30)，(P<0.01))。鉴于DNA为细胞核标志物，结果提示超临界二氧化碳处理能更好去除骨组织中的细胞核。
(三)三组模型动物植入不同处理的骨组织后诱导成骨能力比较
植入4周后，实验组观察到植入物被少量纤维组织包绕，成纤维细胞聚集，有多个骨生发中心，成骨活跃、骨髓丰富;常规对照组观察到植入物被少量纤维组织包绕，成纤维细胞聚集，有少量的骨生发中心，未见明显的成骨细胞，有骨髓形成;阳性对照组的成骨表现与常规对照组相似，植入物被少量纤维组织包绕，有少量骨生发中心，未见明显的成骨细胞，有骨髓形成。
(四)三组模型动物植入不同处理的骨组织后诱导成骨蛋白表达量比较
免疫组织化学结果显示，实验组COL-1、ALP、OCN和RUNX2表达较常规对照组和阳性对照组均有增加的趋势，但差异无统计学意义，提示实验组可能具有更好的成骨活性。
四、讨论
动物源性骨修复材料中残留的抗原成分会引起不良免疫应答，是造成炎症反应、影响骨修复效果的重要原因。降低这些残留物的水平可以减少炎症反应，有利于脱细胞材料更好地发挥骨诱导能力。本研究将超临界二氧化碳萃取技术和传统物理化学的脱细胞技术进行对比，通过ELISA法测定α-Gal抗原清除率、荧光染色法检测残留DNA的方式观察超临界二氧化碳萃取技术的脱细胞效果，并通过裸鼠体内诱导成骨组织学和免疫组织化学评估超临界二氧化碳脱细胞材料的体内成骨特性。
α-Gal和DNA分别为细胞膜和细胞核的标志物，对这两个指标的检测可以全面地评价脱细胞效果。本研究显示，超临界二氧化碳脱细胞处理的实验组α-Gal抗原清除率和残留DNA含量均显著优于常规对照组，显示出更加优异的脱细胞效果。
裸鼠体内诱导成骨试验是评价骨修复材料成骨能力最有效的方法之一，通过对植入物在体内组织学和成骨相关蛋白的表征，可以全面、直接地反映材料的诱导成骨能力。本研究中HE染色结果显示，实验组有多个骨生发中心，成骨活跃、骨髓丰富，而常规对照组和阳性对照组仅观察到少量骨生发中心，未见明显的成骨细胞;免疫组织化学结果显示，实验组成骨相关蛋白(ALP、RUNX2、COL-1和OCN)的表达量较常规对照组和阳性对照组均有增加的趋势。以上结果充分证明超临界二氧化碳脱细胞处理后的动物源性骨修复材料的诱导成骨能力优于常规脱细胞处理后的材料。
综上所述，相较于传统物理化学脱细胞方式，超临界二氧化碳可以凭借其较高的渗透率深入组织内部，更加彻底地去除组织里的免疫原性物质，同时避免材料在化学溶液中的暴露，从而更好地保存生物活性。使用基于超临界二氧化碳的脱细胞工艺为动物源性骨组织脱细胞提供了新思路，本研究结果也证明了超临界二氧化碳脱细胞可以获得更安全、更有效的生物产品，具备较大的临床应用潜力。
志谢
研究得到浙江省“尖兵”“领雁”研发攻关计划(2022C03089)支持。
医学伦理
本研究遵循本机构和国家有关实验动物管理和使用的规定，并通过浙江中医药大学动物实验研究中心实验动物伦理委员会审查(IACUC-20230410-07)，实验动物使用许可证号为SYXK(浙)2021-0012。
利益冲突
本研究所用脱细胞骨修复材料为浙江狄赛生物科技有限公司产品。
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