摘要：目的：探究铁调素(hepcidin)在肝纤维化过程中发挥的抗纤维化作用及其调控的主要靶细胞。方法：构建含有hepcidin的重组腺相关病毒AAV-hepcidin，肝组织切片Masson染色和实时荧光定量PCR(qPCR)评估过表达hepcidin对四氯化碳肝纤维化模型的保护作用。利用qPCR、免疫印迹及免疫荧光标记检测膜铁转运蛋白(ferroportin,FPN)在小鼠原代肝星状细胞(p-HSCs)和巨噬细胞RAW264.7中的表达差异。检测含有hepcidin的条件培养基对转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1,TGF-β1)刺激下p-HSCs活化的作用，检测柠檬酸铁铵(FAC)对p-HSCs活化及铁死亡的影响，以及hepcidin对RAW264.7极化的影响。结果：冰冻切片和酶联免疫吸附试验(ELISA)结果显示，hepcidin在小鼠肝脏内实现高表达。肝组织Masson染色和qPCR结果显示，发生肝纤维化时，过表达hepcidin的小鼠肝组织纤维化程度较对照组减轻。FPN在RAW264.7中的表达量高于其在p-HSCs的表达量。经含有hepcidin的条件培养基和TGF-β1处理后，q-PCR和蛋白质印迹法结果显示，hepcidin对p-HSCs的活化无明显抑制作用。经FAC刺激后，FAC对p-HSCs的活化及铁死亡相关指标无明显作用。含有hepcidin的条件培养基和脂多糖(LPS)处理RAW264.7后，炎症相关基因及蛋白质的表达水平均较对照组下降，说明hepcidin可以有效抑制巨噬细胞向M1型极化。结论：Hepcidin在肝纤维化进展过程中起保护作用，其主要通过抑制小鼠肝巨噬细胞向M1型转化发挥抗纤维化作用。
关键词：肝纤维化;肝星状细胞;巨噬细胞;铁调素;膜铁转运蛋白
论文《铁调素调节巨噬细胞极化发挥抗纤维化作用的研究》发表在《中国生物工程杂志》，版权归《中国生物工程杂志》所有。本文来自网络平台，仅供参考。
肝纤维化是多种慢性肝脏疾病的常见后果，包括病毒性、酒精性、代谢性和自身免疫性肝脏疾病[1]。肝纤维化是一个复杂的病理过程，不同的常驻和非常驻异质肝细胞群之间相互作用，最终导致过度累积的细胞外基质(ECM)取代受损的正常组织，破坏肝脏的生理结构[2-4]。肝脏中参与肝纤维化进程的细胞主要包括肝星状细胞(HSCs)和肝巨噬细胞等[5]。在生理条件下，HSCs存在于Disse腔内，富含类视黄醇脂滴，表现为静止表型。在肝脏发生损伤后，静止HSCs分化为肌成纤维细胞样细胞[6]。HSCs激活后可促进ECM、促炎细胞因子和蛋白酶分泌，进一步诱导细胞损伤和纤维化[7]。在纤维化过程中，巨噬细胞分泌多种促纤维化因子，包括转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、促炎细胞因子白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等，诱导HSCs活化，促进纤维化发展[8]。
作为维持铁稳态的重要器官，肝脏在铁代谢中发挥重要作用[9]。在慢性肝病患者，如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、代谢相关脂肪性肝病等患者中，均可观察到肝脏铁沉积的情况[10-11]。哺乳动物体内铁稳态主要由铁调素(hepcidin)来调节，hepcidin是一种主要由肝细胞分泌的含25个氨基酸的肽类激素[12]，hepcidin作用的靶分子膜铁转运蛋白(FPN)是目前已知唯一的细胞内铁输出蛋白，hepcidin通过与FPN结合，引起FPN内吞和降解，从而使细胞内的铁输出减少，发挥铁调节作用[13]。肝纤维化患者常出现严重的肝脏铁超载，提示hepcidin可能在肝纤维化的进展中发挥重要作用[14]。如果hepcidin可以缓解纤维化进展，那么其是否通过调节HSCs的活化或者肝巨噬细胞的极化来发挥作用?
本课题拟在小鼠体内过表达hepcidin，观察hepcidin对四氯化碳(CCl₄)诱导的肝纤维化的缓解作用。在体外通过利用含有hepcidin的条件培养基或柠檬酸铁铵(FAC)，观察hepcidin或铁对HSCs的活化及其对巨噬细胞的极化是否产生影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂
胎牛血清、青霉素链霉素双抗、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITS-X)购自普诺赛公司;DEME/F12培养基、DMEM培养基购自美国Gibco公司;逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司;PowerUp™ SYBR™ Master Mix购自美国ThermoFisher公司;ColI抗体、α-SMA抗体、iNOS抗体、GPX4抗体购自美国Abcam公司;TIMP-1抗体购自博奥森公司;GAPDH抗体购自Absin公司;FPN抗体购自美国Novus公司;山羊抗兔荧光二抗、SLC7A11抗体、Nrf2抗体购自Proteintech公司;TGF-β1购自美国Peprotech公司;LPS、Trizol Reagent购自美国Sigma公司;高效RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、橄榄油购自Solarbio公司;四氯化碳(CCl₄)购自天津大茂化学试剂公司;荧光封片剂(含DAPI)购自中杉金桥公司。
1.1.2 实验动物、细胞和重组病毒
本研究中所用的实验动物均为雄性无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级别的C57BL/6小鼠;小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞购自普诺赛公司;小鼠原代肝星状细胞(p-HSCs)根据文献[15]中的方法从小鼠肝组织中通过门静脉灌注、密度梯度离心分离获得，并经本课题组鉴定;小鼠肝细胞系AML12细胞购自美国模式培养物研究所(American Type Culture Collection,ATCC);含有GFP和hepcidin的重组腺相关病毒AAV-GFP和AAV-hepcidin由赛业公司包装合成;含有GFP和hepcidin的重组慢病毒LV-GFP和LV-hepcidin由吉凯基因包装合成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
p-HSCs使用含15%胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养;RAW264.7使用含10%胎牛血清和1%青霉素链霉素双抗的DMEM培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养;AML12细胞使用含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素双抗和1%ITS-X的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。
1.2.2 条件培养基
在24孔板中接种培养AML12细胞数量为5×10⁴个，按照病毒感染复数(MOI)为5，将慢病毒LV-GFP和LV-hepcidin感染AML12细胞。成功感染LV-GFP和LV-hepcidin的AML12细胞培养24h后，吸取上清液，即为含有GFP和hepcidin的条件培养基。
1.2.3 实验分组
- 实验动物分组：为验证重组病毒的肝脏感染效率，单纯重组病毒感染小鼠分为AAV-GFP组和AAV-hepcidin组(每组4只)，尾静脉注射病毒4周后取肝组织进行冰冻切片染色观察。为验证重组病毒在小鼠血清中的表达量，将单纯重组病毒感染小鼠分为对照(con)组、6w-AAV-GFP组和6w-AAV-hepcidin组(每组4只);重组病毒感染6周后，通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠血清中hepcidin含量。肝纤维化模型小鼠分为con组、CCl₄组、AAV-GFP+CCl₄组、AAV-hepcidin+CCl₄组(每组6~8只)。其中AAV-GFP+CCl₄组和AAV-hepcidin+CCl₄组，病毒注射1周后，与CCl₄组同样经腹腔注射CCl₄(浓度为12.5%，注射剂量为10μL/g)6周，每周2次。Con组以相同剂量和频次注射橄榄油6周。以上注射重组病毒剂量均为每只小鼠1.2×10¹¹ GC。
- 含有hepcidin的条件培养基和TGF-β1处理p-HSCs：将p-HSCs细胞以8×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后，分为con、TGF-β1、GFP+TGF-β1和hepcidin+TGF-β1组，每组设置2个平行对照，用相应条件培养基处理24h后，TGF-β1、GFP+TGF-β1和hepcidin+TGF-β1组每孔分别加入20ng/mL TGF-β1刺激24h或48h。
- FAC刺激p-HSCs：将p-HSCs细胞以8×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后，分为con组和FAC组，每组设置2个平行对照，FAC组加入100μmol/L的FAC刺激24h或48h。
- 含有hepcidin的条件培养基和LPS处理RAW264.7：将RAW264.7细胞以8×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，细胞贴壁后，分为con组、LPS组、GFP+LPS组和hepcidin+LPS组，每组设置2个平行对照，用相应条件培养基处理4h后，LPS组、GFP+LPS组和hepcidin+LPS组加入100ng/mL LPS刺激6h。
1.2.4 小鼠肝组织冰冻切片
将肝组织在4%多聚甲醛中固定，然后依次在不同浓度的蔗糖溶液中梯度脱水，在10%蔗糖溶液中脱水4~6h后，置于20%的蔗糖溶液中过夜。将组织取出，修剪至合适大小后放置于包埋盒内，使用OCT包埋机包埋后冻存于-80℃，使用冰切机以8~15μm的厚度切片，置于载玻片上，DAPI染色，观察绿色荧光。
1.2.5 ELISA
设置标准孔、待检测样品孔、空白孔。标准孔共设置5孔，依次加入50μL不同浓度的标准品，在空白孔中加入50μL标准品稀释液，其他孔中加入50μL待测样品后，每孔加入50μL待测溶液A工作液，振动混匀，酶标板加覆膜，30℃孵育1h。弃掉孔内液体，每孔加350μL洗涤液洗涤，浸泡1~2min，重复洗板3次。每孔加100μL检测溶液B工作液，加上覆膜37℃孵育30min，弃掉孔内液体后洗板5次，加入底物溶液每孔90μL，加覆膜后37℃避光显色，加入终止溶液每孔50μL，终止反应，使用酶标仪在450nm波长测量各孔光密度。
1.2.6 Masson染色
1. 石蜡切片脱蜡：①烤箱设置为60℃，烤片1h;②二甲苯透明，二甲苯I和二甲苯II各浸泡5min;③100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次浸泡2min;④流水冲洗切片2min后，在蒸馏水中浸泡10s。
2. 染色：①苏木素染液染色5min，流水冲洗1min;②1%盐酸乙醇分化数秒，流水冲洗数分钟;③丽春红酸性品红溶液染色5min，流水冲洗;④磷钼酸溶液处理5min;⑤苯胺蓝溶液复染5min;⑥用0.2%冰乙酸冲洗切片，直到无蓝色脱出。
3. 脱水透明封片：①95%乙醇、无水乙醇分别浸泡切片1min;②二甲苯I和二甲苯II分别浸泡切片3min;③中性树胶封片。
1.2.7 实时荧光定量PCR(qPCR)
采用Trizol法提取总RNA，逆转录为cDNA，使用Gapdh基因作为内参，检测小鼠肝组织及p-HSCs纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Timp1、Tgfb的mRNA水平，p-HSCs和RAW264.7的Fpn基因mRNA水平，AML12的Hamp基因mRNA水平，p-HSCs的铁死亡相关基因Fth1、Ftl1、Gpx4、Slc7a11、Nfe2l2的mRNA水平，RAW264.7的炎症相关基因Nos2、Il-1β、Il-6的mRNA水平。引物序列如表1所示。
表1 qPCR引物序列
Table1 Primers sequence of qPCR
| 引物名称 | 引物序列(5'→3') |
| Gapdh | F:CTCCTCGACTCTACTCCTCTCTTC
R:AGTTCTCATATTTCTCCTCCTTCA |
| Fpn | F:CTCCCCCACATTATCACATTTC
R:ATTCCAACCCGAAATAAAACCA |
| Hamp | F:TCCCTCTCTCCTCCTTCT
R:TCTCTCCCCTCCTTTCTT |
| Collal | F:AACGAGATCGACCTCAGACC
R:GACTCTCTTCCCCCAACTTC |
| Acta2 | F:GATCAACCCCAGACCAAGAG
R:CTTTTCCATCTCCTCCCACT |
| Timpl | F:AGGTCCTCTCCTTGATTTCT
R:CTAAGCCCTCTACCTCTCCC |
| Fthl | F:TCTCGAATCCACCAGAACTATC
R:CCTCAAAGTAGACTCCCATCC |
| Fdll | F:ATCCCTTCCACTTTGAACAACC
R:CTCACATCTACTTTCCTCTCCAC |
| Gpx4 | F:CAACCAGTTTCCGACCC
R:CTTCGCCTCGACTTTCAT |
| Sle7all | F:TTCGACCCCTCTCCTATCC
R:CGACCACTTCCACCCAGAC |
| Nfe212 | F:CTTTAGTCACCCACAGAAGGAC
R:AGGCATCTTGTTTCGGAATGTC |
| Nos2 | F:CCAGAGATTCGACCCCTTCTC
R:GGCTTCTTCCTCAACTTCCACTC |
| Il-1β | F:CCACCAGGTTATCATCATCATC
R:CCTCCCACCACCACATCAAC |
| Il-6 | F:AGAGATACAAAGAAATGATCGA
R:AGCTATCGTACTCCACAAGACCA |
| Tgfb | F:CTCCCCTCCCTTCTACTCC
R:GCCTTAGTTTCGACAGGATCTC |
1.2.8 免疫荧光
用PBS清洗细胞3次，4%多聚甲醛固定细胞10min;用PBS清洗3次，每次10min;5%BSA封闭1h;一抗4℃过夜孵育，PBS清洗3次，每次10min;二抗室温孵育1h，PBS清洗3次，每次10min;用含有DAPI的封片剂封片。
1.2.9 免疫印迹
取p-HSCs细胞和RAW264.7细胞，加入含有蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液(RIPA裂解液)，提取蛋白质，采用BCA法测定蛋白质浓度。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)进行蛋白质分离，以GAPDH为内参，分别检测FPN，纤维化相关蛋白ColI、α-SMA、TIMP-1，铁死亡相关蛋白Nrf2、GPX4、SLC7A11，以及炎症相关蛋白iNOS的表达水平。
1.3 统计学处理
本研究数据采用SPSS25.0进行统计学分析，数据应用Graphpad Prism8软件作图，计量资料以均数±标准差($ar{x} pm s$)表示，多组间比较采用One-Way ANOVA，多组间两两比较采用LSD-t检验，$P<0.05$为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠感染AAV-GFP或AAV-hepcidin后实现稳定高表达
为了明确重组腺相关病毒在小鼠肝脏内的感染效率，尾静脉注射重组AAV-GFP和AAV-hepcidin，4周后对小鼠肝脏进行冰冻组织切片，观察绿色荧光的表达情况。结果显示：重组病毒感染4周后小鼠肝脏绿色荧光蛋白表达明显(图1)。在尾静脉注射6周后，通过ELISA检测小鼠血清内hepcidin水平。结果显示：con组小鼠血清hepcidin约为(642.5±93.8)ng/L、6w-AAV-hepcidin组小鼠血清hepcidin约为(1455.7±251.1)ng/L，6w-AAV-hepcidin组小鼠的血清hepcidin水平约为con组小鼠的2.3倍($P<0.01$)，说明尾静脉注射6周后，注射AAV-hepcidin的小鼠体内hepcidin依然保持较高水平(表2)。
图1 AAV-GFP和AAV-hepcidin在小鼠肝脏内绿色荧光表达(AAV-hepcidin同时携带GFP标签)
Fig.1 Expression of green fluorescent in mouse liver by AAV-GFP and AAV-hepcidin (AAV-hepcidin simultaneously carries a GFP tag)
注：在油镜(100×)下观察绿色荧光在小鼠肝脏内的表达情况
表2 尾静脉注射6周后小鼠血清hepcidin水平
Table2 Serum hepcidin levels in mice six weeks after tail vein injection
| Group | Serum hepcidin level/(ng/L) |
| con | 642.5±93.8 |
| 6w-AAV-GFP | 626.1±69.5 |
| 6w-AAV-hepcidin | 1455.7±251.1 |
2.2 Hepcidin在小鼠肝纤维化进展过程中发挥保护作用
在重组腺相关病毒AAV-GFP和AAV-hepcidin分别感染小鼠后1周，通过腹腔注射CCl₄构建肝纤维化模型。造模6周后，小鼠肝组织Masson染色结果显示：与AAV-GFP+CCl₄组相比，AAV-hepcidin+CCl₄组的小鼠肝组织纤维化程度较轻(图2A)。提取小鼠肝组织的RNA进行纤维化相关指标检测，qPCR结果显示：AAV-hepcidin+CCl₄组的纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Tgfb的mRNA表达量分别降至AAV-GFP+CCl₄组的73.0%($P<0.01$)、84.5%($P<0.01$)和62.7%($P<0.05$)(图2B)。以上结果说明，hepcidin在肝纤维化发展过程中发挥保护作用。
图2 CCl₄诱导肝纤维化模型小鼠肝脏Masson染色和纤维化指标变化
Fig.2 Masson staining and fibrosis marker expression in the liver of mice with CCl₄ induced liver fibrosis
注：A：在低倍物镜(20×)和高倍物镜(40×)下观察Masson染色的肝纤维化模型小鼠肝脏纤维化程度;B：各组纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Tgfb的mRNA水平;$*P<0.05$，$P<0.01$
2.3 FPN在巨噬细胞中的表达量高于其在p-HSCs中的表达量
为了明确hepcidin在肝纤维化过程中发挥保护作用的靶细胞，我们分别检测了HSCs和巨噬细胞中FPN的基因和蛋白质表达情况。qPCR结果显示：与p-HSCs相比，Fpn基因在RAW264.7中的mRNA表达升高34.8倍($P<0.01$)(图3A)。免疫印迹结果显示：FPN在RAW264.7中蛋白质表达量显著高于其在p-HSCs中的表达量(图3B)。对RAW264.7和p-HSCs中的FPN进行免疫荧光染色结果显示：FPN在RAW264.7中的荧光亮度强于在p-HSCs中的荧光亮度(图3C)。以上结果均说明FPN在RAW264.7中的表达量高于其在p-HSCs中的表达量，巨噬细胞可能是hepcidin发挥抗肝纤维化作用的主要靶细胞。
图3 FPN在p-HSCs和RAW264.7细胞中的表达量差异
Fig.3 Differential expression of FPN in p-HSCs and RAW264.7 cells
注：A：p-HSCs与RAW264.7两种细胞中Fpn基因mRNA水平;B：p-HSCs与RAW264.7两种细胞FPN蛋白表达水平;C：高倍物镜(100×)下观察p-HSCs与RAW264.7两种细胞FPN免疫荧光染色;$P<0.01$
2.4 Hepcidin对HSCs的活化无明显抑制作用
鉴于HSCs在肝纤维化过程中发挥重要作用，我们对hepcidin是否能直接调节HSCs的活化进行了研究。首先，为了获得过表达hepcidin的条件培养基，我们将携带hepcidin基因的慢病毒感染小鼠AML12细胞。qPCR结果显示：AML12细胞中hepcidin编码基因(Hamp)的mRNA水平约为对照病毒感染组的237倍($P<0.05$)，证明AML12细胞成功过表达hepcidin。利用含有GFP和hepcidin的条件培养基分别处理p-HSCs 24h后，再利用20ng/mL TGF-β1刺激p-HSCs 24h提取RNA或刺激48h提取蛋白质，检测纤维化相关指标的表达情况。qPCR结果显示：TGF-β1组纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Timp1的mRNA表达水平分别约为con组的1.3倍($P<0.05$)、1.6倍($P<0.05$)和1.5倍($P<0.05$)，说明在本实验中TGF-β1可以有效促进p-HSCs活化，hepcidin+TGF-β1组与GFP+TGF-β1组的纤维化基因mRNA表达无明显差异(图4A)。免疫印迹结果显示：hepcidin+TGF-β1组与GFP+TGF-β1组的纤维化相关蛋白表达无明显差异(图4B)。以上结果均说明hepcidin对p-HSCs的活化无明显的抑制作用。
图4 含有hepcidin的条件培养基及TGF-β1刺激p-HSCs后纤维化指标变化情况
Fig.4 Alterations in fibrosis markers in p-HSCs following treatment with hepcidin-conditioned medium and TGF-β1 stimulation
注：A：AML12细胞Hamp基因mRNA水平;B：p-HSCs纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Timp1的mRNA水平;C：p-HSCs纤维化相关蛋白ColI、TIMP-1表达水平;$*P<0.05$
2.5 铁对HSCs的活化无明显促进作用
Hepcidin作用到FPN后，会引起FPN的内吞及降解，进而阻止胞内铁外排。我们随后使用FAC刺激p-HSCs的方法，观察胞内铁负荷对HSCs活化的影响。利用100μmol/L FAC刺激p-HSCs 24h后，检测Fpn基因，纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Timp1，以及铁死亡相关基因Fth1、Ftl1、Gpx4、Slc7a11、Nfe2l2的mRNA表达水平。qPCR结果显示：FAC组Fth1、Ftl1基因mRNA表达约为con组的1.3倍($P<0.05$)和1.6倍($P<0.05$)，说明FAC有效升高细胞内铁含量;其余基因mRNA在con组和FAC组之间无明显差异。100μmol/L FAC刺激p-HSCs 48h后，采用免疫印迹检测纤维化相关蛋白α-SMA、TIMP-1，以及铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、Nrf2的表达水平。免疫印迹结果显示：在con组和FAC组中以上蛋白质表达水平均无明显差异(图5B)。以上结果说明铁对p-HSCs的活化无明显促进作用，且100μmol/L FAC刺激未诱导p-HSCs发生铁死亡。
图5 FAC刺激p-HSCs后纤维化及铁死亡相关指标变化情况
Fig.5 Effects of FAC stimulation on fibrosis and ferroptosis-related markers in p-HSCs
注：A：p-HSCs纤维化相关基因Col1a1、Acta2、Timp1的mRNA水平;B：p-HSCs铁死亡相关基因Fth1、Ftl1、Gpx4、Slc7a11、Nfe2l2的mRNA水平;C：p-HSCs纤维化相关蛋白α-SMA、TIMP-1的表达水平;D：p-HSCs铁死亡相关蛋白GPX4、SLC7A11、Nrf2的表达水平;$*P<0.05$
2.6 Hepcidin可以抑制巨噬细胞向M1型转化
鉴于hepcidin和铁对HSCs的活化都无明显作用，且FPN在巨噬细胞中高表达，因此我们进一步对hepcidin对巨噬细胞极化的调节作用进行了探究。将体外培养的RAW264.7细胞先利用含有GFP和hepcidin的条件培养基处理4h后，再利用100ng/mL LPS处理6h，提取细胞RNA和蛋白质。qPCR结果显示：LPS组Nos2、Il-1β、Tgfb基因mRNA表达分别约为con组的1.9倍($P<0.05$)、2.9倍($P<0.01$)和1.8倍($P<0.01$)。免疫印迹结果显示：LPS组iNOS蛋白表达约为con组的5.4倍($P<0.01$)，说明在本实验中LPS可以有效促进RAW264.7向M1型极化。qPCR结果显示：hepcidin+LPS组Nos2、Il-1β、Il-6、Tgfb基因mRNA表达水平分别降至GFP+LPS组的66.3%($P<0.05$)、67.6%($P<0.01$)、70.3%($P<0.05$)和58.1%($P<0.05$)(图6A)。免疫印迹结果显示：hepcidin+LPS组iNOS蛋白表达水平下降至GFP+LPS组的74.2%($P<0.05$)(图6B)。以上结果说明hepcidin抑制巨噬细胞向M1型极化。
图6 含有hepcidin的条件培养基和LPS刺激RAW264.7后炎症指标变化情况
Fig.6 Changes in inflammatory markers in RAW264.7 cells after treatment with hepcidin-conditioned medium and LPS simulation
注：A：RAW264.7炎症相关基因Nos2、Il-1β、Il-6、Tgfb的mRNA水平;B：RAW264.7炎症相关蛋白iNOS的表达水平;$*P<0.05$，$P<0.01$
3 讨论
目前已有研究表明hepcidin过表达后可以有效减少小鼠肝脏的炎症和代谢相关性脂肪性肝炎引起的肝纤维化[16]。为了研究hepcidin对肝纤维化的作用，我们通过构建CCl₄肝纤维化模型，发现过表达hepcidin组纤维化程度较对照组减轻，证实了hepcidin对CCl₄诱导的肝纤维化具有保护作用。
为了明确hepcidin发挥抗纤维化作用的主要细胞，我们分别检测了hepcidin作用的靶分子FPN在HSCs和巨噬细胞上的表达丰度。结果表明小鼠巨噬细胞系RAW264.7中FPN的基因和蛋白质表达水平均明显高于p-HSCs中的表达量。免疫荧光结果显示，FPN在RAW264.7中的荧光亮度明显强于p-HSCs，以上结果均表明，FPN在巨噬细胞中表达明显高于其在HSCs中的表达，即hepcidin可能主要通过作用于巨噬细胞发挥抗纤维化作用。
尽管HSCs中FPN的表达较低，但HSCs是肝纤维化过程中发挥作用的主要细胞，且有研究称hepcidin可以通过直接调节HSCs的活化来缓解肝纤维化[17]，所以本研究进一步探究了hepcidin对HSCs活化的作用。使用含有hepcidin的条件培养基和TGF-β1刺激p-HSCs后，qPCR和免疫印迹结果均显示hepcidin组与对照组相比，纤维化相关基因与蛋白质表达水平无明显差异。造成这种结果的差异可以解释为，本实验所用HSCs为小鼠原代HSCs，且使用过表达hepcidin慢病毒感染的小鼠肝细胞分泌的条件培养基刺激HSCs与巨噬细胞，以检测两种细胞对hepcidin的作用效果，相比其他研究小组所使用的大鼠肝星状细胞系或大鼠原代HSCs[16-17]，更接近于小鼠模型体内过表达hepcidin后肝脏HSCs和巨噬细胞对hepcidin调节的反应。
Hepcidin可以通过结合FPN后，使其内吞降解，减少胞内铁排出，本研究通过FAC直接刺激p-HSCs的方式，研究铁对于p-HSCs活化有无直接影响。qPCR和免疫印迹结果显示，FAC组纤维化相关基因和蛋白质的表达与对照组均无明显差异，证明铁对于p-HSCs活化无明显的直接作用。由于细胞内过量铁沉积可能导致铁死亡，为避免本实验所使用的FAC浓度导致细胞铁死亡对实验结果造成影响，我们通过qPCR和免疫印迹检测了铁死亡相关基因和蛋白质的表达水平，结果显示在基因和蛋白质水平，FAC组和对照组均无明显差异，证明实验所用浓度的FAC不会导致细胞铁死亡。以上结果说明，本实验所使用的含有hepcidin的条件培养基与铁均未对HSCs的活化产生明显调节作用。
由于hepcidin对HSCs活化无明显作用，且hepcidin的靶分子FPN在巨噬细胞中高表达，我们推测hepcidin可能主要通过调节巨噬细胞的极化发挥抗纤维化作用。利用含有hepcidin的条件培养基和LPS刺激RAW264.7后，qPCR和免疫印迹结果显示，hepcidin+LPS组炎症相关基因mRNA和蛋白质表达均低于GFP+LPS组，说明hepcidin作用于巨噬细胞可有效抑制其向M1型转化，hepcidin在肝纤维化发展过程中主要通过调节巨噬细胞的极化发挥抗纤维化作用。
鉴于HSCs在肝纤维化发展过程中是产生基质胶原的主要细胞，且巨噬细胞在肝纤维化过程中可以通过分泌细胞因子调节HSCs活化，因此推测hepcidin可能会通过调节巨噬细胞的极化而间接作用于HSCs，进而发挥抗纤维化作用。后期我们将进一步研究经hepcidin处理的巨噬细胞对HSCs活化的调节作用。
4 结论
综上所述，本研究明确了hepcidin在CCl₄诱导的肝纤维化进展过程中的保护作用，证实hepcidin和铁对小鼠HSCs的活化无明显作用，hepcidin可以通过抑制小鼠肝巨噬细胞向M1型转化发挥抗纤维化作用。
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